酶解技術在腰果蛋白制備中的應用

高林，朱小天，鄧晶晶，梁宇，吳繼紅

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，北京100083）

酶解技術在腰果蛋白制備中的應用

高林，朱小天，鄧晶晶，梁宇，吳繼紅*

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，北京100083）

以剝殼后所得等外果及碎腰果果仁為原料，采用低溫冷榨取油結合溶劑浸提的方法，獲得二浸腰果餅粕，將其油脂含量降低至2.99%，蛋白含量為34.61%；利用酸沉淀法，結合α-淀粉酶的作用對腰果蛋白進行提取，探究酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酸沉淀pH、料液比對所得蛋白純度的影響，確定最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量為底物量的2.0%、酸沉pH為4.50；選取酶解pH、料液比、溫度3個因素作為響應面優(yōu)化因素進一步優(yōu)化了工藝參數(shù)并結合實際，最終獲得最佳提取工藝為：pH7.0、溫度60℃、料液比1∶10（g/mL），產(chǎn)品粗蛋白純度可達到64%。

腰果；植物蛋白；酶解技術；α-淀粉酶；工藝優(yōu)化

腰果（Anacardium occidentale L.）又名介壽果、雞腰果，為世界著名四大干果之一［1］。腰果仁美味可口，營養(yǎng)價值豐富，深受消費者喜愛［2］。目前市面上比較常見的產(chǎn)品除未經(jīng)加工的生腰果，多以奶香腰果、炭燒腰果、鹽焗腰果等初加工產(chǎn)品為主［3］。隨著人們生活水平的提高與保障腰果產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展，對等外果及碎果仁的進一步利用，進行精深加工成為腰果產(chǎn)業(yè)勢在必行的發(fā)展趨勢。

腰果仁蛋白質(zhì)含量（約20%）豐富，且蛋白質(zhì)的氨基酸組成種類齊全，人體必需氨基酸占氨基酸總含量的31%，約占腰果仁蛋白質(zhì)總量的25%，符合營養(yǎng)學規(guī)定的必需氨基酸需求量與蛋白質(zhì)需求量的比例范圍（20%～37%）［4］。且其氨基酸組成比例與WHO建議的人體氨基酸模式非常接近，優(yōu)于其它堅果類產(chǎn)品如杏仁、榛子、核桃等［5］。鑒于目前腰果市場產(chǎn)品形式單一、產(chǎn)業(yè)附加值低、腰果蛋白市場空缺，對其制備工藝的探索可以為延長腰果深加工產(chǎn)業(yè)鏈并實現(xiàn)腰果碎果仁資源綜合利用提供理論指導，具有重要意義。

由于腰果脫油后的餅粕中含有與蛋白含量相當?shù)牡矸郏瑢ρ鞍踪|(zhì)提取和純化具有一定的影響，將酶解技術應用于腰果蛋白的提取工藝，即選取α-淀粉酶將淀粉水解為可溶解于體系液相中的糊精、低聚糖、麥芽糖及葡萄糖，使其得到有效去除，同時達到提高蛋白得率、改善蛋白品質(zhì)的目的。本研究對原料進行低溫冷榨結合溶劑浸提脫除油脂后，通過α-淀粉酶作用于蛋白提取工藝，探究酶解技術應用于腰果蛋白制備工藝的最優(yōu)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

帶殼腰果：山東萬思頓農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園有限公司非洲科特迪瓦種植基地；腰果仁：由該公司經(jīng)其意大利進口自動化生產(chǎn)線剝殼后所得產(chǎn)品中的等外果及碎腰果果仁。

α-淀粉酶（酶活力20 000 U/g）：諾維信生物技術有限公司；石油醚、氫氧化鈉、硼酸、五水合硫酸銅硫酸銨、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇、甲基紅等（均為分析純）：購買于北京化工廠。

1.2主要儀器與設備

泰航牌液壓式榨油機180：鄭州泰航機械設備有限公司；PB-10Sartorius pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；LKTC-CZ水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司；BSXT-02索氏提取器：上海比朗儀器有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀：KETUO公司；DHG-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；BSA822電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司等。

1.3試驗方法

1.3.1腰果壓榨餅粕的制備

原料經(jīng)過清理、除雜等工序后，用一層紗布包裹，采用液壓式榨油機進行冷榨處理，升壓速率為4 MPa/ min，升壓至40 MPa，保持3 min后泄壓排渣，重復2次后，得到壓榨腰果餅粕［6］。

1.3.2腰果脫脂粉的制備

取腰果壓榨出油后餅粕，按照如下步驟制備腰果脫脂粉［7］：壓榨后餅粕→烘干（置于50℃烘箱中烘干24 h）→萬能粉碎機粉碎→過篩→低溫浸提除油以1∶5（g/mL）的料液比，向物料中加入石油醚，于常溫下置于磁力攪拌器上攪拌浸提12 h，料液分離，重復3次，最后常溫脫除溶劑→粉碎并過篩→獲得腰果脫脂粉。

1.3.3腰果蛋白粉提取工藝

腰果脫脂粉→以一定料液比加入蒸餾水攪拌調(diào)漿→調(diào)節(jié)溶液pH（溶解）→加入α-淀粉酶→恒溫水浴震蕩→沸水浴滅酶→冷卻至常溫→鹽酸調(diào)pH（酸沉淀）→離心→取沉淀→冷凍干燥→腰果粗蛋白粉產(chǎn)品［8］。

1.3.4指標測定

水分含量測定：GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量測定：GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量測定：GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測定》。

1.3.5響應面設計優(yōu)化提取工藝

采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理［9］，結合單因素試驗結果，探究酶解pH值、料液比、酶解溫度對蛋白產(chǎn)品純度的影響，因素及水平見表1。

表1　提取響應面優(yōu)化因素水平表Table 1Factors and levels in the RSM of protein extraction

2　結果與分析

2.1不同加工階段腰果蛋白質(zhì)和脂肪的變化

由于新鮮腰果含油量約50%，若企業(yè)采用液壓式壓榨機進行二次冷壓榨，盡管可獲得大部分油脂，但餅粕殘油率仍高達28%。加之腰果不同于其他含油原料，其淀粉含量較高，冷榨或熱榨過程中，淀粉對出油率的提高帶來一定限制。為了降低多次壓榨的成本，本試驗采用溶劑提取的方法進一步將脂肪脫除，不同加工階段腰果的蛋白質(zhì)和脂肪含量見表2。

表2　不同加工階段腰果的蛋白質(zhì)和脂肪含量Table 2Protein and oil content of cashew nut in various stages

由表2可知，通過不同的脫脂工藝，最終獲得油脂含量2.99%的脫脂腰果粉，其蛋白含量約為35%。

2.2酶解單因素對蛋白提取的影響

2.2.1α-淀粉酶添加量對蛋白提取的影響

α-淀粉酶添加量對蛋白提取率的影響如圖1所示，α-淀粉酶添加量為0%～2.0%時，蛋白產(chǎn)品的純度隨α-淀粉酶添加量的增加而顯著提高，當酶量為2.0%時，純度可達54%，可能是加入淀粉酶可有效促進淀粉發(fā)生水解［10］，同時影響到細胞壁的碳骨架，有助于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、油脂釋出；加入4.0%、6.0%、10.0%、12.0%的α-淀粉酶酶解，產(chǎn)品差異不顯著，且均顯著低于2.0%的提取率，說明在2.0%的α-淀粉酶可以充分與底物作用使淀粉水解［11］，最終確定α-淀粉酶添加量為底物量的2.0%。

圖1　α-淀粉酶添加量對粗蛋白純度的影響Fig.1Effect of enzyme dosage on purity of cashew protein

2.2.2溶液pH值對蛋白提取的影響

以試驗用酶的參考pH值范圍5.5～7.5進行單因素試驗，隨著酶解pH值的增加，粗蛋白純度先增加，在酶解pH值7.0處達到最大，之后又下降。蛋白質(zhì)在低于和高于其等電點pH值，帶有凈的正電荷或凈的負電荷，帶電的氨基酸殘基的靜電推斥和水合作用促進蛋白質(zhì)的溶解［12-13］。由于腰果蛋白質(zhì)大多為酸性蛋白質(zhì)［14］，其在酸性溶液（pH值為5.5～6.5）時溶解度較低，加上過低的pH值會抑制酶的活性，而同時溶液過高的pH值會使得酶失活從而降低蛋白的溶解率和淀粉的水解率［15］，且pH值越高蛋白越容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，只有在特定的pH值條件下（6.5～7.5）如圖2，才能處于最佳解離狀態(tài)。

圖2　酶解pH值對粗蛋白純度的影響Fig.2Effect of solution pH on purity of cashew protein

2.2.3提取溫度對蛋白提取的影響

圖3所示，隨著酶解溫度的增加，蛋白質(zhì)含量先增加，在酶解溫度55℃左右達到最大，之后又迅速下降。一方面，溫度的升高可以提高反應速率，另一方面，溫度促使腰果蛋白親水基團展開，有助于其溶解度升高［16］；酶解溫度過高粗蛋白純度下降可能是由于淀粉酶被鈍化［17］，或腰果蛋白的疏水基團被過多的展開而使得蛋白質(zhì)分子之間相互聚集，溶解度下降所致［18］。

圖3　酶解溫度對粗蛋白純度的影響Fig.3Effect of temperature on purity of cashew protein

2.2.4酸沉淀pH值對蛋白提取的影響

蛋白質(zhì)的溶解性受到料液pH的影響，當料液pH值接近蛋白質(zhì)等電點時，主要蛋白質(zhì)將不溶于液相中［19］（但仍有少量的低分子蛋白會溶解，所以會有部分蛋白質(zhì)的損失），而可溶性糖類、淀粉酶作用后的淀粉水解物、其他可溶性物質(zhì)，都可以溶解于水中［20］，因此可利用酸溶液調(diào)節(jié)料液pH值，將脫脂腰果粉中的可溶性非蛋白質(zhì)成分去除，從而獲得腰果蛋白。由圖4可見，隨著酸沉pH值增大，所獲得的蛋白純度先增大，在pH值4.5～5.0處達到最大，之后又逐漸下降，說明腰果蛋白的等電點應在pH值4.5～5.0之間，最后選取酸沉淀pH值為4.5。

圖4　酸沉淀pH值對粗蛋白純度的影響Fig.4Effect of pH of acid extraction solution on purity of cashew protein

2.2.5料液比對蛋白提取的影響

料液比對腰果蛋白提取的影響如圖5所示，隨著提取液體積的增加，所得蛋白的含量逐漸增大，但料液比為1∶10（g/mL）和1∶12（g/mL）時，沒有顯著性差異（P＞0.05），說明當料液比達到1∶10（g/mL）時，物料在提取液中已較為完全分散開，蛋白質(zhì)溶解達到飽和，酶解反應充分［21］。由于加水量過多，酸沉時上清液中殘留的清蛋白量增加，不容易被離心下來，造成較高的蛋白的損失［22］，試驗操作中就可以看出，加水量更多的料液比組合將不再被繼續(xù)探究。

圖5　料液比對粗蛋白純度的影響Fig.5Effect of solid-to-liquid ratio on purity of cashew protein

2.3響應面優(yōu)化酶解提取蛋白工藝

應用Design Expert 8.0軟件進行分析，得到二次多項回歸模型為：粗蛋白產(chǎn)品純度/%=+62.69+3.47×A+ 3.52×B+5.08×C-2.00×A×B-1.02×A×C+0.65×B×C-2.51× A2-7.69×B2-4.55×C2。ANOVA分析結果表明，模型P值小于0.01，而失擬的P值大于0.05，方程的相關系數(shù)R2=0.996 8，CV值為2.43%共同說明了模型的可靠性，能夠較好地反映真實的試驗值［23］。

表3　響應面分析法的ANOVA分析Table 3ANOVA of the constructed regression model

表3中顯示，3個因素的線性、平方項影響均為極顯著，酶解pH和料液比的交互影響顯著，說明這些因素對蛋白提取均有顯著性影響。各因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖，從等高線圖可以直觀反映出兩個變量間相互的作用。兩因素之間交互作用的等高線和響應面圖見圖6。

如圖6所示，酶解pH值和料液比的等高線呈橢圓形表明，交互作用對腰果蛋白提取影響顯著，其它因素兩兩交互的等高線圖呈圓形，表明其作用不顯著。通過軟件分析計算得出理論最佳提取工藝條件為：pH值7.16、溫度57.77℃、料液比1∶10.13（g/mL）。此時理論提取率為65.21%。為便于實際控制，選擇提取pH 7.0、溫度60℃、料液比1∶10（g/mL）進行驗證試驗，得到的粗蛋白純度為64.10%，與理論值差別不大（1.70%）。

圖6　兩因素之間交互作用的等高線和響應面圖Fig.6Contour line and curve surface for the effect of two-factor on extraction efficiency

3　結論與展望

采用壓榨與溶劑浸提結合的方法對剝殼后所得的等外果及碎腰果果仁脫除油脂，獲得腰果脫脂粉，其油脂含量降低至2.99%，蛋白含量達到34.61%；利用酸沉淀法，結合α-淀粉酶的作用對腰果蛋白進行提取，探究酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酸沉淀pH值、料液比對粗蛋白純度的影響，確定最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量為底物量的2.0%、酸沉pH值為4.5；選取酶解pH值、料液比、溫度3個因素作為響應面優(yōu)化因素進一步優(yōu)化了工藝參數(shù)，pH值7.0、溫度60℃、料液比1∶10（g/mL），產(chǎn)品粗蛋白純度可達到64%。

本實驗通過腰果蛋白的提取研究，旨在為延長腰果深加工產(chǎn)業(yè)鏈并實現(xiàn)資源綜合利用，開發(fā)營養(yǎng)價值高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性好、工藝簡單且有利于工業(yè)化生產(chǎn)的高附加值腰果蛋白產(chǎn)品提供理論指導，今后還將繼續(xù)對腰果蛋白粉沖調(diào)性、功能品質(zhì)等做進一步探究。

［1］左亞文，郭興峰，王雨辰，等.我國腰果生產(chǎn)加工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與前景［J］.中國果業(yè)信息，2013，30（11）：13-18

［2］Teuber S S，Sathe S K，Peterson W R，et al.Characterization of the soluble allergenic proteins of cashew nut（Anacardium occidentale L.）［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2002，50（22）：6543-6549

［3］鄭淑娟，羅金輝.世界腰果產(chǎn)銷發(fā)展概況及前景［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2013，39（24）：50-52

［4］趙麗，黃海杰.我國腰果研究概況［J］.中國南方果樹，2012，41（2）：41-46.

［5］Ogunwolu S O，Henshaw F O，Mock H P，et al.Functional properties of protein concentrates and isolates produced from cashew（Anacardium occidentale L.）nut［J］.Food Chemistry，2009，115（3）：852-8

［6］吳繼紅，郭興峰，朱斌，等.腰果蛋白粉及其制備方法：2013106996100［P］.2013-12-18

［7］郭興峰，陳計巒，林燕，等.熱榨和冷榨核桃餅粕中蛋白質(zhì)提取及其性質(zhì)研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2012，28（18）：287-292

［8］王瑛瑤，王璋.水酶法從花生中提取油與水解蛋白的研究［J］.食品與機械，2005，21（3）：17-20

［9］林建原，季麗紅.響應面優(yōu)化銀杏葉中黃酮的提取工藝［J］.中國食品學報，2013（2）：83-90

［10］盛小娜，王璋，許時嬰.水酶法提取甜杏仁油及水解蛋白的研究［J］.中國油脂，2008，32（11）：26-30

［11］呂曉燕，董英.紫甘薯淀粉酶解工藝條件優(yōu)化及其噴干粉的制備［J］.食品與機械，2010（3）：124-128

［12］楊波，楊光，張靜.水酶法提取花生蛋白工藝的研究［J］.食品科學，2007，27（11）：253-256

［13］Qin Z，Guo X，Lin Y，et al.Effects of high hydrostatic pressure on physicochemical and functional properties of walnut（Juglans regia L.）protein isolate［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2013，93（5）：1105-1111

［14］鐘俊楨，頓儒艷，黃宗蘭，等.腰果蛋白的提取工藝條件優(yōu)化［J］.食品科學，2014，35（16）：18-22

［15］霍莉，王頡.苦菜蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（20）：50-53

［16］王璋，許時嬰，湯堅.食品化學［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999

［17］王成，榮玉芝，李虎，等.α-淀粉酶水解對芭蕉芋淀粉理化性質(zhì)的影響［J］.食品與藥品，2014，16（4）：229-232

［18］Yuliana M，Truong C T，Huynh L H，et al.Isolation and characterization of protein isolated from defatted cashew nut shell：Influence of pH and NaCl on solubility and functional properties［J］.LWT-Food Science and Technology，2014，55（2）：621-626

［19］李新華，閆榮.遼西大扁杏杏仁蛋白的組成及堿法提取工藝的研究［J］.食品科技，2009（5）：132-135

［20］Kumar K S，Ganesan K，Selvaraj K，et al.Studies on the functional properties of protein concentrate of Kappaphycus alvarezii（Doty）Doty-An edible seaweed［J］.Food chemistry，2014，153：353-360

［21］Sun W，Gao S，Wang L，et al.Microwave-assisted protein preparation and enzymatic digestion in proteomics［J］.Molecular&Cellular Proteomics，2006，5（4）：769-776

［22］邵佩蘭，徐明.提取大豆分離蛋白的工藝研究［J］.糧油加工與食品機械，2006（9）：47-48

［23］劉梁，孫維礦，趙玲，等.響應面法優(yōu)化米糠蛋白的酶解工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（3）：76-81

The Application of Aqueous Enzymatic Technology on Preparation of Cashew Nut Protein

GAO Lin，ZHU Xiao-tian，DENG Jing-jing，LIANG Yu，WU Ji-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，National Engineering Research Center for Fruits and Vegetables Processing，Key Laboratory of Ministry of Agriculture Vegetables，Beijing 100083，China）

The cold-pressed technique and low temperature was used to solvent extraction technology to remove oil.Then，the defatted cashew nut（contains 2.99%oil and 34.61%protein）was used to extract crude protein by aqueous enzymatic method.During the process of its extraction，the effect of the enzyme dosage，extracting solution pH，extraction temperature，solid-to-liquid ratio and the acid precipitator pH on the purity of protein were investigated using single factor experiment and response surface experiment，the optimum conditions were obtained as follows：the 2.0%enzyme dosage，7.0 for the extracting solution pH，60°C of extraction temperature，1∶10（g/mL）of solid-to-liquid ratio and 4.5 for the acid precipitator pH，which will provide theoretical direction for the development of cashew nut products.

cashewnut；vegetableprotein；aqueousenzymatictechnology；alphaamylase；processoptimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.013

2015-10-13

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項“優(yōu)質(zhì)高效富硒農(nóng)產(chǎn)品關鍵技術研究與示范”（201303106）

高林（1988—），女（漢），博士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

吳繼紅（1964—），女（漢），教授，博士生導師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工技術與理論研究。