陜西產葛根藥材的HPLC指紋圖譜研究

北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠（100079）王海 姚璐 魏弘宜 遲玉明

葛根為豆科植物野葛P u e r a r i a lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習稱野葛，在中國大部分地區均有分布[1]。葛根主要有效成分為黃酮類物質[2]，主要有大豆苷元（daidzein）、大豆苷（daidzin）、葛根素（puerarin）、大豆苷元4’,7-二葡萄糖苷、7-木糖苷葛根素（7-xyloside puerarin）等[3]。中醫認為葛根味甘辛，性平，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經活絡，解酒毒等作用[4]。現代藥理研究表明，葛根能改善實驗性心肌梗塞犬的心肌代謝，能改善高血壓病人的項強、頭暈、頭痛、耳鳴等癥狀[5]。臨床用于外感發熱頭痛、項背強痛，口渴，消渴，麻疹不透，熱痢，泄瀉，眩暈頭痛，中風偏癱，胸壁心痛等癥[6]。

中國藥材公司曾進行全國中藥資源普查，結果表明我國葛根資源分布廣泛[7]，其中川產葛根[8]、貴州產葛根[4]、云南產葛根[9]的HPLC指紋圖譜研究均有報道，陜西省是葛根藥材的重要產地之一，然而陜西產葛根的質量研究較少見于報道[10][11]。本實驗選用陜西省產葛根藥材，建立原藥材的高效液相指紋圖譜，以對葛根原藥材及制劑進行質量控制。

1 實驗部分

儀器與試藥：Waters 2695-2996高效液相色譜儀，Em-power色譜工作站，2996二極管陣列檢測器。葛根干燥浸提物HRS（Code：Y0001200；Id：0038E9）由European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare提供。葛根對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：110752-200912）。16批葛根樣品由北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠提供，均采自陜西安康葛根基地。乙腈為色譜純，由Burdick & Jackson提供，其余為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取葛根藥材粉末0.1g，置錐形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，濾過，取續濾液，用微孔濾膜（孔徑為0.45μm）濾過，濾液作為供試品。

2.2 對照品溶液的制備 稱取相當于3.0mg葛根素的葛根干燥浸提物HRS于250mL錐形瓶中，加入30%乙醇50.0mL，稱重。加熱回流30min，溫度降至室溫后再次稱重，用30%乙醇補足失重，混合搖勻，過濾。

2.3 色譜條件 ①色譜柱：phenomenex Onyx Monolithic C18 100×4.6mm。②色譜條件：2根同系列色譜柱，長度0.10m，直徑4.6mm，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流速3.0mL/min；檢測波長260nm；柱溫30℃；梯度洗脫（見附表1）。

2.4 方法學考察

2.4.1 測定>方法 分別精密吸取葛根干燥浸提物HRS 10μL和供試品溶液3μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。

2.4.2 峰識別 用葛根干燥浸提物HRS提供的色譜圖和對照藥材色譜庫獲得的色譜圖來歸屬異黃酮類成分的7個共有峰。（3’-羥基葛根素，葛根素，3’-甲氧基葛根素，6-O＂-D-木糖-葛根素，大豆苷等）。葛根素保留時間約為7.0min，其他特征峰的保留時間、峰面積與葛根素峰比較的相對保留時間和相對峰面積（見附表2）。

2.4.3 精密度試驗 取同一批次供試品，按照2.3色譜條件及2.4.1測定方法檢測指紋圖譜，連續進樣6次，在同一臺儀器上測定指紋圖譜（見附表3），結果表明，各色譜峰的相對保留時間基本一致，其中各共有峰相對保留時間RSD值均小于1.0%，峰面積RSD值小于4.42%，表明該方法進樣精密度好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一批次供試品溶液，分別于制樣后0h，2h，16h后按照2.3色譜條件及2.4.1測定方法檢測指紋圖譜（見附表4），結果表明，各共有峰的保留時間RSD小于1.01%，除7號峰外，其余共有峰峰面積RSD均小于2.0%。因此，認為供試品溶液至少在16h內穩定。

2.4.5 重復性實驗 取同一批次葛根藥材，平行制樣6份，按照2.3色譜條件及2.4.1測定方法檢測指紋圖譜（見附表5），結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于1.02%，峰面積RSD值均小于4.07%，表明該方法具有較好的重復性。

2.5 指紋圖譜及技術參數

2.5.1 指紋圖譜及共有峰的標定 按照對照品及供試品溶液的制備及檢測方法制備樣品溶液，分析比對葛根干燥浸提物HRS提供的色譜圖及16批次陜西產葛根藥材供試品的HPLC檢測結果，總結共有7個共有峰（見附圖1）包括：3’-羥基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、6-O＂-D-木糖-葛根素、大豆苷等。其中，葛根素保留時間約為7.0min，其他特征峰的保留時間、峰面積與葛根素峰比較的相對保留時間及相對峰面積（見附表3），通過計算中藥材供試品的圖譜及指紋圖譜比較，非公有峰面積為總峰面積的8.2%。

2.5.2 不同批次陜西產葛根藥材指紋圖譜的相似度評價 以16批次不同陜西產葛根藥材的HPLC指紋圖譜（見附圖2）進行數據分析，并建立共有模式，取共有模式作為這批樣品的對照譜，采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件，進行相似性分析，相似度均不低于0.9（見附表6）。

附表1 流動相梯度洗脫程序

附表2 指紋圖譜分析結果

附表3 精密度試驗結果

附表4 穩定性試驗結果

附表5重復性試驗結果

附表6 16批葛根藥材相似度計算結果

附圖1 葛根干燥浸提物圖譜。峰2：3’-羥基葛根素；峰3：葛根素；峰4：3’-甲氧基葛根素；峰5：6-O＂-D-木糖-葛根素；峰6：大豆苷

附圖2 16批葛根藥材指紋圖譜相似度評價結果圖

3 討論

利用中藥材指紋圖譜進行定性或定量分析是當前中藥質量評價的主流，通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制樣品的質量，確保質量的相對穩定。陜西省是葛根藥材的重要產地之一，而關于陜西產葛根藥材的指紋圖譜研究鮮見于報道，故本次試驗重點研究了陜西產葛根藥材指紋圖譜的建立。

在選擇供試品溶液的制備方法時，本次試驗對提取溶劑、提取方法及提取溶劑濃度進行了考察，以葛根素含量及總異黃酮含量為考察指標進行評價。提取溶劑的考察涉及30%甲醇及30%乙醇，對比考察結果，認為乙醇作為提取溶劑效果較好。提取方法的考察中對比了超聲及回流的方法，實驗結果表明回流方法較好。最后對比了20%乙醇、30%乙醇、60%乙醇、80%乙醇的提取結果，認為30%乙醇作為提取溶劑，葛根素及總異黃酮含量較高。最終確定以30%乙醇加熱回流30分鐘作為提取方法。

葛根的主要化學成分為異黃酮類成分為黃酮類化合物、三萜類、香豆素類等，其中黃酮類化合物的含量達12% 。葛根主要有效成分為葛根素，葛根素為異黃酮類化合物，其色譜峰無明顯干擾，故本次實驗選葛根素為參照峰，即S峰，以S峰面積作為1，計算其他各共有指紋峰面積的比值[12][13]。

通過分析本次試驗的精密度實驗結果、穩定性實驗結果、重復性實驗結果，以及植物圖譜的相似度，認為該16批樣品具有較好的相似性，因此認為此次建立的葛根藥材指紋圖譜適用于陜西產地的葛根藥材。