Hsa-miR-498對腎上腺皮質癌細胞SW-13增殖及凋亡的影響△

趙欣　張學斌　李漢忠

中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院泌尿外科/北京協和轉化醫學中心，北京100730

Hsa-miR-498對腎上腺皮質癌細胞SW-13增殖及凋亡的影響△

趙欣張學斌#李漢忠

中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院泌尿外科/北京協和轉化醫學中心，北京100730

目的探索微小核糖核酸（micro RNA）Hsa-miR-498對腎上腺皮質癌細胞（SW-13）增殖及凋亡的影響，并初步預測其靶基因。方法將SW-13細胞分為3組，空白對照組（A組）為未接受轉染細胞，陰性對照組（B組）為無意義寡聚核苷酸和LipofectamineTM2000轉染試劑按1∶1混合轉染，敲低組（C組）為轉染Has-miR-498 inhibitor組。使用RT-PCR檢測各組中Has-miR-498的表達情況；應用MTT法測定各組細胞的生長曲線；采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細胞的凋亡率；并用miRDB初步預測與Hsa-miR-498相關的靶基因。結果經RT-PCR檢測發現C組細胞中Hsa-miR-498表達下降；MTT結果顯示，與A、B組相比，C組細胞增殖能力下降（P＜0.05）；Annexin V-FITC/PI雙染法結果顯示，A、B組相比，C組細胞凋亡率增加，但差異無統計意義（P＞0.05）。經miRDB初步預測Has-miR-498與細胞增殖及凋亡最相關的靶基因為CD93和JHDM1D。結論降低Hsa-miR-498在SW-13中的表達可抑制SW-13的增殖并促進其凋亡。表明Hsa-miR-498可能與SW-13的增殖及凋亡相關。

腎上腺皮質癌細胞；細胞增殖；細胞凋亡；微小核糖核酸-498

Oncol Prog，2016，14（6）

腎上腺皮質腫瘤（adrenalcortical tumor，ACT）是內分泌系統常見的腫瘤，尸檢中發現率為7.3%。在引起腎上腺皮質醇癥的腎上腺皮質腫瘤中，腎上腺皮質腺瘤占10%，腎上腺皮質癌（adrenalcortical carcinomas，ACC）占6%［1］。

微小RNA（micro RNA）是一種短鏈非編碼RNA，它的主要作用為調控靶mRNA的表達，與多種疾病的發生發展密切相關。Hsa-miR-498位于19q13.41，研究表明，Hsa-miR-498在卵巢癌、乳腺癌、結直腸癌等疾病起病中起重要作用［2-4］，尚無研究探索Hsa-miR-498在腎上腺皮質癌中的作用。本研究旨在初步探索Hsa-miR-498對腎上腺皮質癌細胞增殖及凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

腎上腺皮質癌細胞系SW-13（中國醫學科學院細胞中心）。

主要試劑包括：L15培養基（中國醫學科學院細胞中心）；胎牛血清（美國Gibco公司）；miR引物、U6引物（上海英俊生物技術有限公司）；miRNA Inhibitor套裝（蘇州吉瑪生物技術公司）；LipofectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）；MTT四甲基偶氮唑鹽（美國Sigma公司）；Annexin V-FITC（美國Invitrogen公司）。經蘇州吉瑪生物技術公司設計合成相應的Has-miR-498 inhibitor。陰性對照無意義寡聚核苷酸序列為：5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'。

主要儀器包括：細胞培養箱（美國Thermo Scientific Forma公司）；Eppendorf 5417c離心機（德國Eppendorf公司）；SMA4000分光光度計（北京Meriton公司）；流式細胞儀（美國Beckman Courlter公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及實驗分組SW-13細胞培養于L15培養基中（含10%胎牛血清），置于37℃、無CO2環境的細胞培養箱中傳代。取對數生長期細胞進行實驗。分為3個實驗組，每組細胞3個復孔，每孔3000～10000個細胞。其中A組為空白對照組，為未接受轉染細胞。B組為陰性對照組，無意義寡聚核苷酸和LipofectamineTM2000轉染試劑按1∶1混合。C組為轉染Has-miR-498 inhibitor組，即敲低組。

1.2.2體外轉染轉染前24 h取對數生長期長勢良好的SW-13細胞，以每孔3×103個細胞置于24孔培養板中，37℃，無CO2細胞培養箱中培養24 h。細胞融合達50%～60%時，將LipofectamineTM2000轉染試劑盒Hsa-miR-498 inhibitor按1∶1混合，孵育15 min，加入24孔板中，6 h后更換培養液，培養24 h后重復轉染一次，然后繼續培養24 h。

1.2.3RT-PCR檢測各組Has-miR-498的表達情況使用Trizol法提取各組細胞樣本總RNA，以U6作為內參照進行校正和標準化。RT反應程序為16℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。RTPCR反應程序為95℃，5 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；反應40個循環。通過各組產物的標準曲線及熔解曲線，得到各反應管循環閾值Ct，應用GenePix ProV6.0進行數據分析。實驗重復3次。定制的引物序列為：

Has-miR-498 RT Prime 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACGAAAAA-3' 5'-GCTTTCAAGCCAGGGGGCG-3' 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACAAAATATG-3' 5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3' U6 RT Prime

1.2.4MTT法檢測3組細胞的生長曲線①接種細胞：用L15培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000～ 10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。②培養細胞：培養0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。③顯色：在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的相應時間點，每孔加MTT溶液（5 mg/ml用PBS配）20 μl繼續孵育4 h，終止培養。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。④讀取OD值：選擇570 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以0 h、24 h、48 h、72 h、96 h時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測3組細胞凋亡率①離心收集懸浮細胞，微量離心機轉速2000 rpm，離心時間5 min，棄培養基。②用冷PBS洗滌細胞兩次（2000 rpm，5 min，收集細胞）。③用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度約為1×106/ml。④在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入10 μl PI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5 min。⑤在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.2.6Hsa-miR-498靶基因的初步預測經miRDB靶點預測工具（http://mirdb.org/miRDB/），對Hsa-miR-498靶基因進行初步預測。

1.3統計學方法

使用SPSS17.0軟件處理數據。各組實驗-均獨立重復3次，實驗數據采用均數±標準差（±s）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。當P＜0.05時差異有統計學意義。

2　結果

2.1RT-PCR檢測結果

A、B、C組2-ΔΔCt值分別為（1.00±0.00）、（1.12± 0.15）和（0.46±0.11）。C組細胞中Has-miR-498表達明顯低于A組和B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2MTT法測定3組細胞的生長曲線

C組細胞在48 h、72 h和96 h增殖率（29.80%± 1.45%，37.67%±0.59%和45.1%±1.10%）低于A組（34.60%±3.47%，41.20%±0.78%，54.00%±1.59%）和B組（36.37%±1.15%，47.17%±2.55%，53.35%± 0.28%），差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1　3組細胞的生長曲線

2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

Hsa-miR-498在SW-13細胞中敲低后，A、B、C組細胞凋亡率分別為1.92%±0.82%，2.11%±0.76%和4.95%±0.81%，C組細胞凋亡率高于A、B組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4Hsa-miR-498靶點預測

經miRDB預測Hsa-miR-498有多個靶基因，包括PDK3、JHDM1D、CD93、NAP1L3、DCTN4、KCNK10、CCPG1等。發現其中與細胞增殖、凋亡、血管形成最相關的靶基因為JHDM1D和CD93。

3　討論

Micro RNA具有復雜功能和調控途徑。有研究提示Hsa-miR-498與散發三陰性乳腺癌的發病有關，在三陰性乳腺癌組織中表達明顯上調，BRCA1為其靶基因，可能是一種癌基因［2］。Gopalan［4］的研究顯示，Hsa-miR-498在結直腸癌組織中表達下調，能促進結直腸癌細胞增殖，與結直腸癌的發生有密切關系，可能是一種抑癌基因。有研究提示卵巢癌組織中Hsa-miR-498下調提示預后欠佳，其主要的靶基因為FOXO3［3，5］，可能是一種腫瘤抑制因子。Wang等［6］研究指出Hsa-miR-498在非小細胞肺癌中明顯下調，并與疾病的進展有關。本研究中實驗結果顯示，Hsa-miR-498可促進腎上腺皮質癌細胞的增殖，具有部分癌基因特征，HsamiR-498表達敲低后，腎上腺皮質細胞增殖明顯下降，因此可作為治療腎上腺皮質腫瘤靶向藥物的潛在靶點。但同時也應該關注將其用作靶向藥物時帶來的不良反應，尤其是導致其他組織腫瘤的發生，比如結直腸癌、卵巢癌等。

Hsa-miR-498有多個的靶點，經miRDB靶點預測工具發現其與腫瘤發生最相關的靶基因為JHDM1D和CD93［7-8］。這些靶基因有獨特的細胞功能，比如細胞增殖、血管形成和凋亡等，為進一步探索Hsa-miR-498作用途徑提供了線索。

本研究發現敲低腎上腺皮質癌細胞中的HsamiR-498后，腎上腺皮質癌細胞的增殖能力降低，提示Hsa-miR-498可促進腎上腺皮質癌細胞的增殖。但查閱文獻目前尚無Hsa-miR-498在腎上腺皮質癌組織中表達上調的報道，因此Hsa-miR-498可能僅有促進腎上腺皮質癌細胞增殖的作用，有部分癌基因特征，這對理解腎上腺皮質腫瘤的發病提供了新的線索，但目前資料無法評價其促使腎上腺皮質細胞惡變的作用。進一步研究應檢測其在腎上腺良性腫瘤及腎上腺皮質癌中的表達，以評價其與腎上腺皮質細胞增殖的關系，以及主要的靶基因和信號傳導途徑。

［1］Alan J，Wein LRAW.Campbell-Walsh Urology［M］.10th ed.Elsevier，2012:1693.

［2］Matamala N，Vargas MT，Gonzalez-Campora R，et al.MicroRNA deregulation in triple negative breast cancer reveals a role of miR-498 in regulating BRCA1 expression［J］.Oncotarget，2016，7（15）:20068-20079..

［3］Cong J，Liu R，Wang X，et al.Low miR-498 expression levels are associated with poor prognosis in ovarian cancer［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（24）:4762-4765.

［4］Gopalan V，Smith RA，Lam AK.Downregulation of microRNA-498 in colorectal cancers and its cellular effects［J］.Exp Cell Res，2015，330（2）:423-428.

［5］Liu R，Liu F，Li L，et al.MiR-498 regulated FOXO3 expression and inhibited the proliferation of human ovarian cancer cells［J］.Biomed Pharmacother，2015，72:52-57.

［6］Wang M，Zhang Q，Wang J，et al.MicroRNA-498 is downregulated in non-small cell lung cancer and correlates with tumor progression［J］.J Cancer Res Ther，2015，11（Suppl）: C107-C111.

［7］Nawrocki MJ，Strugala AJ，Piotrowski P，et al.JHDM1D and HDAC1-3 mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus［J］.Z Rheumatol，2015，74（10）:902-910.

［8］Galvagni F，Nardi F，Maida M，et al.CD93 and dystroglycan cooperation in human endothelial cell adhesion and migration adhesion and migration［J］.Oncotarget，2016，7（9）: 10090-10103.

The effect of Hsa-miR-498 on proliferation and apoptosis of human adrenal cortical carcinoma cell line SW-13△

ZHAO Xin ZHANG Xue-bin#LI Han-zhong
Department of Urology/Translational Medicine Center，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate the effect of Hsa-miR-498 on proliferation and apoptosis of human adrenal cortical carcinoma cell line SW-13，and try to determine the target genes.MethodThe cell line was divided into three groups，including blank group（group A），negative control（NC）group（group B），and inhibitor group（group C），with no transfection，transfection of oligonucleotide and LipofectamineTM2000 transfection reagent（1∶1），and transfection of Has-miR-498 inhibitors，respectively.RT-PCR was applied to determine the expression of the Has-miR-498 in each group；then the proliferation was tested by MTT and the apoptosis by Annexin V-FITC/PI.The target genes of Hsa-miR-498 were predicted using miRDB.ResultRT-PCR showed that Has-miR-498 was knocked down in group C；MTT showed that，compared with group A and group B，proliferation slowed in group C；And in Annexin V-FITC/PI，it was found that knocking down Hsa-miR-498 could mildly promote apoptosis of SW-13 cells，though no statistically significant difference was observed（P＞0.05）.By miRDB analysis，CD93 and JHDM1D were most probably related to the proliferation and apoptosis of SW-13 cell line.ConclusionKnocking down Hsa-miR-498 could reduce proliferation and mildly promote apoptosis of SW-13 cells，suggesting a correlation between them.

adrenocortical carcinoma cell；cell proliferation；cell apoptosis；Has-miR-498

R736.6

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.11

2016-04-19）

國家自然科學基金（81070628）

（corresponding author），郵箱：xuebinzh@126.com