酶法與高效液相色譜法測定糖化血紅蛋白的結(jié)果比對分析

黃艷萍　王星

摘要：目的 評估高效液相色譜法（HPLC）與酶化學(xué)法測定糖化血紅蛋白的結(jié)果相關(guān)性和偏倚。方法 使用全自動糖化血紅蛋白儀D-10采用高效液相色譜法和東芝TBA-120全自動生化分析儀以酶化學(xué)法分別測定40例EDTA-K2抗凝血液樣本糖化血紅蛋白，對結(jié)果進(jìn)行分析比較；計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，直線回歸方程和預(yù)期偏倚。結(jié)果 全自動糖化血紅蛋白儀D-10高效液相色譜法的測定均值為7.78%，TBA-120全自動生化分析儀酶化學(xué)法測定均值為7.74%，線性回歸方程為y=1.0349x-0.3111，r2=0.9923，無顯著性差異（P>0.05），糖化血紅蛋白可接受偏倚大于預(yù)期偏倚可信區(qū)間上限。結(jié)論 酶化學(xué)法與高效液相色譜法結(jié)果相關(guān)性良好，可滿足臨床要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；酶化學(xué)法；糖化血紅蛋白

糖化血紅蛋白Alc（HbAlc）是反映血液中葡萄糖水平的一個中長期指標(biāo)，國際上通常將其做為糖尿病血糖控制的"金指標(biāo)"[1]。目前我室采用高效液相色譜法和酶化學(xué)法，為給臨床提供可靠地檢測結(jié)果，比較兩種檢測方法測定HbAlc的差異，探討其可比性，現(xiàn)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)的EP9-A2文件[2]，對其進(jìn)行比較分析。

1資料與方法

1.1一般資料 收集我院住院患者糖化血紅蛋白標(biāo)本40例，均為EDTA-K2抗凝全血。

1.2儀器和試劑 高效液相色譜法：全自動糖化血紅蛋白儀D-10及配套試劑標(biāo)準(zhǔn)品；酶化學(xué)法：日本東芝TBA-120全自動生化分析儀，試劑和標(biāo)準(zhǔn)品為九強(qiáng)公司提供的HbAlc測定試劑；質(zhì)控品為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，批號為33860.

1.3方法

1.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 根據(jù)NCCLS EP5-A文件的要求進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。采用美國Bio-Rad公司的中值質(zhì)控和高值質(zhì)控。批內(nèi)不精密度實(shí)驗(yàn)：同一天將2份質(zhì)控品連續(xù)定20次；批間不精密度實(shí)驗(yàn)：將2份質(zhì)控品測定1次/d，連續(xù)測定20d。

1.3.2方法學(xué)評價 以全自動糖化血紅蛋白儀D-10高效液相色譜法為比較方法，將標(biāo)本放置在樣本架上直接自動進(jìn)樣測定；另一份標(biāo)本以東芝TBA-120全自動生化分析儀酶化學(xué)法為試驗(yàn)方法，將九強(qiáng)HbAlc試劑中的a1和a2以7：3混合，作為前處理液，將標(biāo)本混勻，吸取20μL溶于250μL的前處理液中，使紅細(xì)胞溶解釋放血紅蛋白，將溶解液放進(jìn)測試孔位進(jìn)行測定，反應(yīng)類型為一點(diǎn)法。依據(jù)EP9-A2文件的要求，8個/d標(biāo)本在不同的分析批測定，將標(biāo)本按照1～8和8～1的順序做兩遍，進(jìn)行相關(guān)性分析和偏倚評估。

1.4數(shù)據(jù)處理

1.4.1離群點(diǎn)檢驗(yàn) 將每一個標(biāo)本經(jīng)兩種方法的前后兩個測定值一一對應(yīng)，依次求出差值，并計(jì)算出所有標(biāo)本中的平均差值，以4倍的平均差值為判斷限值。若僅有一個離群點(diǎn)，將之剔除，繼續(xù)下述分析；如離群點(diǎn)超過2個，應(yīng)分析原因，然后再另用標(biāo)本補(bǔ)做。

1.4.2繪制散點(diǎn)圖和偏倚圖 以全自動糖化血紅蛋白儀D-10高效液相色譜法的測定結(jié)果為X，東芝TBA-120全自動生化分析儀酶化學(xué)法測定值為Y，繪制散點(diǎn)圖?？梢灾庇^的觀察異常值、線性程度、偏倚。

1.4.3計(jì)算線性回歸方程 y=a+bx和r2。

1.4.4臨床可接受性判斷 將b和a以及Xc（HbAlc）醫(yī)學(xué)決定水平值[3]代入SE=|（b-1）Xc+a|，以SE是否小于或等于1/2CLIA'88規(guī)定的允許誤差（TEα）判斷是否可接受。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)，使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1精密度評 按照臨床實(shí)驗(yàn)室管理要求批內(nèi)不精密度低于1/4 TEα，批間不精密度低于1/3TEα；經(jīng)計(jì)算求得，糖化血紅蛋白兩種檢測方法的批內(nèi)CV均小于1/4 TEα（6.67%），批間CV均小于1/3TEα（6.67%），說明試驗(yàn)方法和比較方法的精密度符合要求，比對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，見表1。

2.2散點(diǎn)圖和偏倚圖 將40例標(biāo)本所得的數(shù)據(jù)繪制成散點(diǎn)圖和偏倚圖。散點(diǎn)圖以東芝TBA-120全自動生化分析儀酶化學(xué)法兩次測定的均值為Y軸，比較方法以全自動糖化血紅蛋白儀D-10高效液相色譜法兩次測定的均值為X軸，見圖1。偏倚圖以兩種方法兩次測定均值的差值為Y軸，以高效液相色譜法兩次測定的均值為X軸，以直線X=0為水平中線，見圖2。

圖1 D-10與TBA-120測定HbAlc的均值散點(diǎn)圖

圖2 D-10與TBA-120測定HbAlc的差值偏倚圖

2.3離群點(diǎn)檢驗(yàn) 經(jīng)查方法內(nèi)，方法間均無離群點(diǎn)。

2.4線性回歸計(jì)算 y=1.0349x-0.3111，r2=0.9923，r2>0.95，說明兩種方法相關(guān)性良好，見圖3。

圖3 D-10與TBA-120測定HbAlc的線性回歸圖

2.5高效液相色譜法（HPLC）與酶化學(xué)法測定結(jié)果 HPLC與酶法測定HbAlc無顯著性差異（P>0.05），結(jié)果見表2

2.6偏倚評估 把HbAlc醫(yī)學(xué)決定水平值代入SE=|（b-1）Xc+a|，見表3。從表3可以看出HbAlc可接受偏倚大于預(yù)期偏倚可信區(qū)間上限，SE≦1/2CLIA'88規(guī)定的允許誤差（TEα），說明兩方法結(jié)果相當(dāng)，可被臨床接受。

3討論

HbAlc可反映近2～3個月的血糖平均水平，國際上將其作為糖尿病血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)，對預(yù)示微小血管病變，評估糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展有著重要的臨床意義。目前臨床實(shí)驗(yàn)室用于檢測HbAlc的方法很多，主要有離子交換層析法、電泳法、膠乳免疫法等，其中離子交換層析法主要有高效液相色譜法和微柱法[4]，美國臨床化學(xué)協(xié)會（AACC）糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化分會和國際臨床化學(xué)協(xié)會（IFCC）糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化工作組建議，以高效液相色譜法作為檢測HbAlc的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。使其它方法參照此法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。酶化學(xué)法測定HbAlc在普通自動生化儀上廣泛應(yīng)用，測定前要手工前處理，測定結(jié)果受人為因素影響較大，離子交換高效液相色譜法是利用離子交換的材料固定相來分離離子型化合物的方法，是糖化血紅蛋白自動分析儀的常用方法，該法快速、精密、準(zhǔn)確。

本次實(shí)驗(yàn)將酶化學(xué)法和高效液相色譜法按照EP9-A2文件進(jìn)行比對，結(jié)果顯示兩者相關(guān)性良好，r2=0.9923，r2>0.95，且均有較好的精密度，兩法的測定結(jié)果相當(dāng)，無顯著性差異，酶化學(xué)法的測定結(jié)果可接受，可滿足臨床需要。

通過對兩種檢測方法間HbAlc檢測結(jié)果的比對，判斷兩種方法的測定結(jié)果無明顯差異，可為HbAlc在不同實(shí)驗(yàn)室間實(shí)現(xiàn)結(jié)果互認(rèn)提供參考依據(jù)，使測定結(jié)果更可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1]李兵.糖化血紅蛋白檢驗(yàn)接軌國際標(biāo)準(zhǔn)[N].健康報，2004：12：21.

[2]叢玉隆，王前.實(shí)用臨床實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社，2011，1，5：77-103.

[3]李池慧，黃續(xù)煒，吳翡斐，等.兩種檢測系統(tǒng)糖化血紅蛋白的比對分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，1，35（1）：90-93.

[4]阮紹均.高壓液相層析法與酶法檢驗(yàn)糖化血紅蛋白的比較[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，27（5）：465-466.

[5]肖弘，王敏，李小盛，等.離子交換高效液相層析法與酶化學(xué)法測定糖化血紅蛋白的比對分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25（11）：888-889.

編輯/孫杰