分光光度計(jì)計(jì)量檢定過程分析與評(píng)定

崔驪

摘要：目的 通過分析分光光度計(jì)檢定中的各種因素，評(píng)估分光光度計(jì)檢定結(jié)果的正誤。方法 計(jì)算檢測(cè)裝置的不確定度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，評(píng)估分光光度計(jì)檢定結(jié)果的正誤。結(jié)果 經(jīng)過分析被檢儀器設(shè)置和標(biāo)準(zhǔn)裝置的不確定度、穩(wěn)定性、重復(fù)性對(duì)檢定的影響，排除了檢定中影響檢定結(jié)果的各種因素。結(jié)論 經(jīng)過分析和評(píng)定，注意設(shè)置被檢儀器，檢定裝置滿足量傳要求，按照規(guī)程操作可以確保分光光度計(jì)的量值準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：分光光度計(jì)；檢定；不確定度；重復(fù)性

分光光度計(jì)是醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室常用的分析儀器，主要功能是對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量、定性的分析，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量[1]。通常使用氧化鈥濾光片，通過全波段掃描，找到其吸光度出現(xiàn)波谷的波長(zhǎng)，然后與定值進(jìn)行比較，可得到波長(zhǎng)示值誤差的數(shù)值。其工作原理是采用可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過分光裝置，產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過測(cè)試樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，最終轉(zhuǎn)化成樣品的濃度，根據(jù)計(jì)算規(guī)律樣品的吸光值與樣品的濃度成正比[2]。

1 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)概述

1.1測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的組成 檢測(cè)波長(zhǎng)采用低壓汞燈波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)器、H849氧化鈥濾光片一塊、P749鐠釹濾光片一塊、G693干涉濾光片三塊、W062近紅外濾光片五塊；檢測(cè)透射比采用三塊Z741可見光透射比濾光片、三塊J566紫外光透射比濾光片；檢測(cè)雜散輻射率采用三塊ZA1105雜散光濾光片。

1.2方法 采用低壓汞燈波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)器、氧化鈥濾光片、鐠釹濾光片檢定波長(zhǎng)；采用金屬石英濾光片檢定透射比準(zhǔn)確度與重復(fù)性，采用雜散光濾光片檢定雜散輻射率[3]。

將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)垂直放入被檢儀器的樣品光路中，讀取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光度測(cè)量值，使用汞燈時(shí)，將汞燈置于光源室，使汞燈的光入射到單色器入射夾縫，選擇能量測(cè)量方式，測(cè)量能量最大時(shí)對(duì)應(yīng)的峰值波長(zhǎng)，檢定被檢儀器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度及重復(fù)性。

2 檢定中應(yīng)注意的問題

2.1儀器性能判斷 在JJG178-2007《紫外、可見、近紅外分光光度計(jì)》檢定規(guī)程中，為了便于描述儀器的計(jì)量性能要求，將儀器的工作波長(zhǎng)分為A段（190nm～340nm）、B段（340nm～900nm）和C段（900nm～2600nm），并把儀器性能從高到低劃分為I級(jí) 、I級(jí)、II級(jí)、IV級(jí)，共4個(gè)級(jí)別[4]。因此在檢定證書中應(yīng)給出每項(xiàng)指標(biāo)在每個(gè)波段的儀器級(jí)別，以方便使用者對(duì)儀器性能的判斷。

2.2基線平直度檢定 基線平直度是指掃描透射比為100和0時(shí)基線傾斜或彎曲的程度。如果基線平直度差，會(huì)使吸收峰之間的比值發(fā)生變化，給儀器定性分析造成困難。導(dǎo)致基線平直度差的主要原因是光學(xué)系統(tǒng)失調(diào)，兩光束不平衡，而儀器受震動(dòng)、光源位置變動(dòng)都會(huì)引起光學(xué)系統(tǒng)故障[5]。因此在測(cè)量時(shí)要讓儀器充分預(yù)熱，并設(shè)置儀器光譜帶寬為2nm，并且在儀器遮光罩關(guān)閉后穩(wěn)定2min后再進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

2.3調(diào)整光譜帶寬 檢測(cè)噪聲、漂移、最小光譜帶寬和基線平直度時(shí)需要調(diào)整光譜帶寬。光柵型儀器中當(dāng)狹縫寬度小于衍射寬度時(shí)，光譜帶寬由衍射寬度決定；當(dāng)狹縫寬度大于衍射寬度時(shí)，光譜帶寬由狹縫寬度決定，狹縫越小，得到的單色光越純，但光的強(qiáng)度降低了。目前，有很多儀器為固定光譜帶寬，容易使光電流的噪聲偏大[6]。

2.4選擇掃描速度 檢測(cè)波長(zhǎng)最大允許誤差時(shí)，需要對(duì)氧化鈥濾光片進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。設(shè)定波長(zhǎng)范圍時(shí)要包含與標(biāo)準(zhǔn)值對(duì)比的波峰波谷，通過儀器說明書確定儀器波長(zhǎng)重復(fù)性，設(shè)置掃描速度時(shí)注意使采樣間隔小于波長(zhǎng)重復(fù)性。如果采樣間隔不能設(shè)定，則應(yīng)設(shè)定掃描速度小于120nm/min。進(jìn)行基線平直度測(cè)量時(shí)，全波段掃描的速度應(yīng)選擇采樣間隔為1nm的速度，若不能設(shè)置采樣間隔，則可選擇掃描速度為400～800nm/min。

3 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

因?yàn)闇y(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的不確定度、穩(wěn)定性、重復(fù)性都可以影響分光光度計(jì)的檢定結(jié)果，所以需要分析影響因素并進(jìn)行評(píng)定。

3.1低壓汞燈波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)器檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)量不確定度 低壓汞燈波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)器的輻射光譜由汞原子內(nèi)部電子躍遷來確定，外部環(huán)境的變化對(duì)其輻射波長(zhǎng)的影響可忽略不計(jì)，在200～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，波長(zhǎng)擴(kuò)展不確定度為0.01nm。

3.2濾波片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢定時(shí)的測(cè)量不確定度 標(biāo)準(zhǔn)濾波片的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書注明：紫外光區(qū)透射比濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和光譜中性濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的透射比不確定度為：U=0.5%（k=2.45）。氧化鈥濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和鐠釹濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)的不確定度為：U=0.3nm（k=2.10）。干涉濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)的不確定度為：U=1nm（k=2.10）。雜散光濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度不確定度為：U=0.1A（k=2.20）。近紅外濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)的不確定度為：U=1nm（k=2）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在研制、制備過程中已對(duì)其復(fù)現(xiàn)的量值進(jìn)行了不確定度分析，故此套標(biāo)準(zhǔn)裝置的不確定度不再評(píng)定

4 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)性評(píng)定

將722S型紫外可見分光光度計(jì)調(diào)至440nm處，對(duì)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)金屬石英濾光片，在短時(shí)間內(nèi)觀察透射比6次，用觀察值的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差Sn（X）表征測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)性。測(cè)量值Xi和Sn（X）計(jì)算如下：

X=19.36%

Sn（X）=■ =■=0.0077%

相對(duì)值：Sn（X）/X=0.0077%/19.36%=4.0×10-4；Sn（X）/小于■uc，符合要求。

5 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性評(píng)定

鐠釹濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、 氧化鈥濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、干涉濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和雜散光濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中已經(jīng)進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，其穩(wěn)定性經(jīng)過驗(yàn)證和審批，因此無需驗(yàn)證。

透射比濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性需要評(píng)定：每隔一個(gè)月，在相同條件（440nm、（23±5）℃）下測(cè)量透射比一次。取n=6個(gè)測(cè)量值的算術(shù)平均值（Xn）i作為一個(gè)觀察結(jié)果。共觀察m=4次，用4次Xm的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差Sm定量表征測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性。

Xm=■（Xn）i/4=19.36

Sm=■ =■=0.0081

相對(duì)值：■=■=0.00042，小于uc符合要求。

6 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的驗(yàn)證

將標(biāo)準(zhǔn)器中紫外光區(qū)透射比濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)送往有資質(zhì)的單位溯源，用其出具的校準(zhǔn)值y0與原出廠認(rèn)定證書的標(biāo)準(zhǔn)值y進(jìn)行比較結(jié)果如下：

標(biāo)準(zhǔn)值y：19.36%

驗(yàn)證值y0：19.39%

■=■=0.15%

7 結(jié)論

檢定分光光度計(jì)的目的是為了確定被測(cè)量的量值，再根據(jù)規(guī)程判斷儀器的測(cè)量結(jié)果是否符合要求，以確保其質(zhì)量安全[7]。在檢定過程中應(yīng)注意各種因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，通過分析和評(píng)定，可以計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)檢定裝置的測(cè)量不確定度、測(cè)量重復(fù)性、穩(wěn)定性的不確定度，并按照規(guī)程規(guī)定判斷其對(duì)結(jié)果的影響。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，分光光度計(jì)檢定裝置的測(cè)量不確定度、測(cè)量重復(fù)性、穩(wěn)定性符合要求，不影響檢定結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/安樺