商品鴨H9亞型禽流感病毒與鴨疫里默氏桿菌混合感染的診斷

閆艷新 孫月萍 劉文華

摘要[目的]對某肉鴨場病死鴨進行病原學診斷。[方法]通過細菌分離培養(yǎng)等常規(guī)細菌學鑒定方法，并結合PCR、RTPCR等分子生物學手段對病死鴨的病原體進行分離與鑒定，并對分離到的細菌進行藥敏試驗。[結果]該批病死鴨的發(fā)病原因確定為H9亞型禽流感病毒與鴨疫里默氏桿菌混合感染。藥敏試驗結果表明，分離的鴨疫里默氏桿菌只對多西環(huán)素、頭孢他啶以及環(huán)丙沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物敏感。[結論]該藥敏試驗結果可為臨床預防和治療鴨疫里默氏桿菌感染的用藥選擇提供一定的參考依據。

關鍵詞 H9亞型禽流感病毒；鴨疫里默氏桿菌；藥敏試驗

中圖分類號 S851.34+7.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-128-03

Abstract[Objective]Pathogenic diagnosis of dead ducks from a duck farm was carried out.

[Method]By using the conventional bacteriological identification method， combined with PCR， RT-PCR and other molecular biological methods， the pathogenic bacteria of dead ducks was seperated and identified， sensitivity test was conducted on the isolated bacteria.[Result]The disease was confirmed to be caused by H9 AIV and Riemerella anatipestifer. Drug susceptibility test revealed that the isolated Riemerella anatipestifer was sensitive to the drug of Doxycycline， Ceftazidime， Ciprofloxacin and Norfloxacin.[Conclusion]The results can provide a certain reference for clinical prevention and treatment of Riemerella anatipestifer infection.

Key words H9 subtype of AIV； Riemerella anatipestifer； Sensitivity test

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）和H9亞型禽流感病毒是長期以來對養(yǎng)鴨業(yè)造成重大危害的2種病原體。鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏桿菌引起鴨的一種急性或慢性敗血病，雛鴨最易感，臨床主要表現神經癥狀，剖檢最典型病變表現為纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎。自然感染發(fā)病率為20%～40%，飼養(yǎng)管理條件差時可使死亡率達50%以上，耐過鴨和病愈鴨常出現生長發(fā)育不良，甚至成為僵鴨，淘汰率極高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經濟損失，已經成為危害商品肉鴨養(yǎng)殖最主要的細菌性傳染病之一[1-2]。鴨疫里默氏桿菌的血清型眾多[3]，我國已發(fā)現的血清型就達16種之多，且各個血清型之間幾乎無交叉保護作用[4]，因而通過疫苗預防該病往往達不到良好的預防效果，臨床上主要還是以藥物治療為主。H9亞型禽流感病毒作為低致病性禽流感病毒，可感染不同日齡的禽類，以前水禽被認為是流感病毒的載體，只攜帶病毒而不表現感染癥狀，但近年來流感病毒引起的水禽感染有不少報道，而與其他病原的混合感染還會引起較高的發(fā)病率和死亡率。

山東省濰坊市某商品肉鴨養(yǎng)殖場的28日齡櫻桃谷鴨出現大批發(fā)病。發(fā)病鴨普遍具有呼吸道癥狀，部分出現神經癥狀。剖檢病死鴨心包膜增厚、心包積液且渾濁，氣囊有白色干酪樣物滲出，氣管出血，胸腺腫大，胰腺出血，脾臟腫大，十二指腸和直腸均有不同程度出血。筆者通過常規(guī)細菌學鑒定方法并結合一些常用的分子生物學手段對病死鴨的病原體進行了分離與鑒定，并通過藥敏試驗尋找該病菌的敏感藥物，旨在為其臨床用藥提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 病料

采自病死鴨的心、肝、腦、脾、肺和氣管等組織。

1.2 試劑

常規(guī)培養(yǎng)基，購自北京路橋技術有限責任公司；犢牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；TSB，購自BD公司；High Pure Viral RNA Kit Version 18，購自Roche 公司；Prime Script One Step RTPCR Kit Version 2試劑盒，購自TaKaRa公司；引物由華大基因公司合成。藥敏紙片按照CLSI標準自制。

1.3 細菌學檢測

1.3.1 細菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學觀察。

無菌挑取病死鴨的心、肝、腦和脾等組織，分別劃線接種于TSA平板、SS瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和普通瓊脂平板上，其中TSA平板進行燭缸培養(yǎng)，將所有平板置于37 ℃下培養(yǎng)24 h觀察。根據各種平板上細菌的生長情況，挑取單菌落進行純化、革蘭染色和瑞氏染色，觀察細菌形態(tài)。

1.3.2 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定。

為了進一步鑒定分離到的細菌是否為鴨疫里默氏桿菌，利用實驗室已建立的針對鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白基因的特異性PCR方法進行驗證[5]，上游引物為5′TGGAGCCAACTATTTGAGAC3′；下游引物為5′CCTTTAATGCTCCTGTTGCT3′，預期擴增片段的長度為660 bp，PCR產物經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后送交擎科生物公司測序。

1.3.3 藥敏試驗。

將濃度調整為108 CFU/mL的新鮮鴨疫里默氏桿菌菌液涂布TSA平板，放置5 min后，按照常規(guī)方法將氟苯尼考和頭孢噻肟等21種臨床常用抗生素藥敏紙片貼于平板表面，37 ℃下作用20 h后觀察結果。按照CLSI標準，進行藥物敏感性評價。

1.4 H5亞型和H9亞型禽流感病毒的RTPCR檢測

1.4.1 引物的選擇。

結合臨床癥狀與病理變化，對流感病毒進行檢測，根據文獻[6-7]分別合成H5亞型和H9亞型禽流感病毒的特異性引物，H5f：5′ACCCAGCCAATGACCTCT3′，H5r：5′CACTTTGCCCGTTTACTT3′；H9f：5′ CAACAAACTCCACAGAAACT 3′，H9r：

5′ ATCTGAACATGCTTTGCTTTG 3′。 H5亞型和H9亞型禽流感病毒的預期擴增片段長度分別為420和380 bp。

1.4.2 RNA提取。

無菌取病死鴨肺臟和氣管，剪碎，按1∶5的比例加入滅菌PBS勻漿，將勻漿液反復凍融2次，12 000 r/min 離心20 min，抽取上層清亮液體，用0.22 μm 濾器過濾除菌，取濾液按照High Pure Viral RNA Kit說明書要求提取病毒RNA。

1.4.3 RTPCR擴增及其產物檢測。

使用一步法RTPCR 試劑盒（PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2）擴增H5亞型和H9亞型禽流感病毒基因片段。采用25 μL 反應體系：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，RNA模板5 μL，超純水4.5 μL，PrimeScript One Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，混勻后置于PCR 儀中進行PCR擴增。PCR擴增程序為：50 ℃反轉錄45 min；94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，將PCR產物送交擎科生物公司測序。

2 結果與分析

2.1 細菌學檢測結果

2.1.1 細菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學觀察。

普通培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上均沒有細菌生長，肝組織在TSA平板上長出無色透明菌落，菌落呈圓形，表面光滑、隆起，邊緣整齊，斜對光觀察有藍光。經過革蘭染色鏡檢可見陰性小短桿狀細菌；經過瑞氏染色鏡檢可見兩極著色。

2.1.2 鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白基因片段的PCR鑒定結果。

對鴨疫里默氏桿菌的外膜蛋白基因片段進行PCR擴增，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳對其PCR產物進行觀察，在660 bp處得到1條明亮的條帶（圖1），與預期片段大小相同，對測序結果進行BLAST比對，確定分離菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.2 鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗結果 根據CLSI標準，判定RA對所用抗生素的敏感程度。由表1可知，分離到的鴨疫里默氏桿菌對大多數臨床常用抗生素耐藥，僅對多西環(huán)素、頭孢他啶、環(huán)丙沙星和諾氟沙星等喹諾酮類藥物敏感。

2.3 病毒學檢測結果

RTPCR擴增H5亞型和H9亞型禽流感病毒，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，H5亞型禽流感病毒沒有擴增到目的條帶，在380 bp處得到1條明亮的條帶（圖2），與H9亞型禽流感病毒預期目的條帶大小相同，測序結果經Blast比對與H9亞型禽流感病毒的同源性達100%，因此確定該批鴨受 H9亞型禽流感病毒的感染。通過細菌學和病毒學檢測，可診斷為該批病死鴨為鴨疫里默氏桿菌和H9亞型禽流感病毒混合感染。

3 討論與結論

鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌是臨床最常見的感染鴨的細菌性病原體。大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌感染鴨均可引起纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，易于混淆。其中，鴨疫里默氏桿菌對營養(yǎng)條件要求較高，一般在普通培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上不能生長，而在添加小牛血清的TSA培養(yǎng)基上生長良好。大腸桿菌和沙門氏菌對營養(yǎng)要求不高，大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上形成紅色菌落，絕大多數沙門氏菌因產生硫化氫在SS培養(yǎng)基上會形成黑色菌落，因此可根據菌株在不同培養(yǎng)基上的生長特性不同進行初步鑒定。近年來，隨著抗菌藥在畜牧養(yǎng)殖領域中的廣泛、大量甚至盲目使用，細菌的耐藥性問題越來越嚴重。很多國家及地區(qū)相繼報道出現了對多種抗菌藥物耐藥的鴨疫里默氏桿菌菌株[8-9]。筆者分離到的鴨疫里默氏桿菌也表現出對大多數常用抗菌藥的耐藥性。這要求在臨床用藥選擇上應根據藥敏試驗有針對性地選擇，并按照聯合、輪換、交叉用藥原則進行藥物配伍。

目前，絕大多數養(yǎng)鴨場都會進行H5亞型和H9亞型禽流感的免疫預防，但由于流感病毒易變異，當流行株和疫苗株不一致時，免疫鴨仍然存在感染的風險。該試驗中檢測到的H9亞型禽流感病毒與鴨疫里默氏桿菌的混合感染并非個例，由于飼養(yǎng)管理不到位和環(huán)境衛(wèi)生條件差所導致的多病原混合感染非常普遍。據報道，H9亞型禽流感病毒與大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒等其他病原體混合感染的協(xié)同作用是導致目前H9亞型禽流感流行的主要原因[10]。鴨疫里默氏桿菌出現與多種病原體混合感染的現象，與鴨疫里默氏桿菌混合感染的細菌種類有大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌[11-13]；與鴨疫里默氏桿菌混合感染的真菌種類有黃曲霉菌[14]；與鴨疫里默氏桿菌混合感染的病毒有鴨肝炎病毒、鴨圓環(huán)病毒、新城疫病毒以及法氏囊病毒[15-16]；鴨疫里默氏桿菌還可以與球蟲等寄生蟲混合感染。混合感染的現象給臨床診斷帶來很大的困難，容易造成誤診或只判斷出某一病原，導致治療不及時，造成巨大的經濟損失。其中，鴨疫里默氏桿菌在商品肉鴨上的感染近幾年也出現了新的流行特點，不再集中于低日齡鴨的感染，臨近出欄的鴨子也開始頻頻發(fā)病，這給肉鴨養(yǎng)殖造成的經濟損失更大。為了預防病毒與細菌等多病原混合感染，養(yǎng)殖場首先應注意加強飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生工作，建立良好的生物安全措施；其次，對病毒病的預防除了根據本地區(qū)疾病的流行情況制訂合理的免疫程序外，還應注意所選用疫苗或卵黃抗體與流行毒株的一致性。

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