1株降解玉米秸稈放線菌的篩選

宋德強 張雯婕 張玲 許婷 葛文雪 朱靜 王兆慧

摘要[目的]篩選出能夠降解玉米秸稈的微生物。[方法]以植物園土層下5 cm取得的腐殖質土壤為樣品進行富集培養，通過剛果紅染色法進行初步篩選，濾紙崩解法進行二次篩選；以玉米秸稈粉為唯一碳源，經25 ℃、180 r/min搖床培養72 h，測定纖維素酶活性；通過形態觀察對菌株進行初步鑒定。[結果]篩選出1株纖維素酶活性最大的菌株WZ16，濾紙酶活性為620 U，CMC酶活性為72 U，通過形態觀察初步鑒定WZ16為鏈霉菌屬放線菌。[結論]最終篩選得到1株有較高纖維素酶活性的鏈霉菌屬放線菌，為綜合利用玉米秸稈作為生物質能源提供了參考。

關鍵詞 秸稈；纖維素水解；篩選；鑒定

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-016-03

Abstract[Objective]To screen a strain of actinomycetes that can degrade corn stalk cellulose.[Method]Enrichment culture was carried out with 5 cm humus subsurface soil at botanical garden as the sample. Preliminary screening was carried out by Congo red staining. Secondary screening was conducted by paper disintegration method. With corn stalk powder as the only carbon source， shake cultivation was carried out at 25 ℃ under 180 r/min for 72 h. Cellulase activity was detected. Strains were preliminarily identified by morphological observation.[Result]A strain WZ16 with maximum cellulase activity was obtained. Filter paper enzyme activity was 620 U， CMC enzymes activity was 72 U. Morphologic observation showed that WZ16 was streptomyces actinomycetes.[Conclusion]A streptomyces actinomycetes with relatively high cellulase activity is finally obtained， which provides references for the comprehensive utilization of corn stalk as biomass energy.

Key words Straw； Cellulolysis； Screening； Identification

我國秸稈年產量達5.7×108 t，占世界秸稈總產量的20%～30%，是生物質能源的重要組成部分[1-2]。如何充分利用這些資源，國外已有詳細研究[3]。但這種寶貴的資源在國內尚未得到充分利用，大部分廢棄秸稈被就地焚燒，不僅造成嚴重的環境污染，威脅人類健康，還會引起火災，威脅飛機起降，影響車輛安全行駛。因此，國家有關部門做了大量工作，加大研究各種秸稈綜合利用技術。目前，國內外秸稈綜合利用主要有5個方面：秸稈肥料化利用；通過物理、化學及生物等方式將作物秸稈轉化為優質畜牧飼料；秸稈沼氣、固化成型等將秸稈開發為能源物質；以秸稈為原料的加工業利用；秸稈基料的應用[4-8]。其中，以秸稈還田、用作飼料和燃燒為主[9-10]。筆者篩選了能夠降解玉米秸稈的微生物，并對其所產生的酶活性進行了測定，以期為綜合利用玉米秸稈作為生物質能源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品。

腐殖質土壤：南通大學植物園玉米地下5 cm的土壤。

玉米秸稈來自南通大學植物園。

1.1.2 培養基。

秸稈粉：2 mol/L NaOH 浸泡玉米秸稈12 h，蒸餾水洗至中性，干燥箱80 ℃過夜，粉碎后200目過篩[11]。

赫奇遜氏無機鹽培養基：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，FeCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2左右[11]。

種子培養基（PDA）：馬鈴薯20000 g煮汁紗布過濾去殘渣，蔗糖20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，固體培養基加18.00 g瓊脂粉[12]。

CMCNa培養基：羧甲基纖維素鈉（CMCNa）10.00 g，馬鈴薯20000 g煮汁紗布過濾去殘渣，瓊脂粉18.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然[11]。

發酵培養基：赫奇遜氏無機鹽培養基 1 000 mL，秸稈粉20.00 g[11]。

高氏I號培養基：可溶性淀粉20.00 g，KNO3 1.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO4 0.50 g，MgSO4 0.50 g，FeSO4 0.01 g，瓊脂20.00 g，水 1 000 mL，pH 7.2～74[12]。

1.1.3 試劑。

0.1%剛果紅，3，5二硝基水楊酸（DNS）顯色試劑，檸檬酸緩沖液[13]，1 mg/mL 葡萄糖標準液。

1.2 方法

1.2.1 富集培養。

1.2.1.1 富集。

將取得的樣品土壤和玉米秸稈混合，置于20 ℃左右培養，定時向土壤撒水以保持土壤的濕潤。培養7 d左右，觀察秸稈是否長出菌斑或菌絲，若無則繼續培養直至長出菌斑或菌絲。

1.2.1.2 分離培養。

取出長有菌斑或菌絲的秸稈，連同秸稈上附著的土壤一起放入裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩30 min后靜置得到菌懸液。用無菌水稀釋，取1×10-3、1×10-4、1×10-5 這3個稀釋梯度溶液各0.2 mL，分別涂布于PDA平板，每個濃度設3個平行，28 ℃培養5～7 d。

觀察各個平板，挑出形態不同的菌株，用PDA平板分離純化得到單菌落并命名，斜面保種。

1.2.2 初篩。

將純化得到的單菌落分別接種于CMC平板上，28 ℃培養3～5 d。將剛果紅染料倒入平板中，為了便于觀察，可在染色前將霉菌菌絲刮去。 染色30 min后棄染液，用1 mol/L NaCl脫色1 h。棄去NaCl后觀察菌落透明圈大小，挑出具有明顯透明圈的菌落，測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），計算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。

1.2.3 復篩。

在裝有50 mL赫奇遜氏無機鹽培養液的三角瓶中放入1 cm×5 cm的無菌濾紙，分別接入篩選得到的菌株（放線菌和霉菌孢子1×106個/mL、酵母菌1×109個/mL），25 ℃、180 r/min搖床培養。每天觀察記錄濾紙崩解的情況，無變化記為（-），濾紙邊緣模糊記為（+），濾紙彎曲記為（++），濾紙變成碎片記為（+++），濾紙整體崩解，變成紙漿記為（++++）[11]。

1.2.4 發酵培養。

挑選出濾紙崩解較嚴重的菌株，以放線菌和霉菌1×106個/mL、酵母1×109個/mL接入發酵培養基（每250 mL錐形瓶接入100 mL），25 ℃、180 r/min搖床培養72 h。

1.2.5 酶活性測定。

1.2.5.1 制備粗酶液。

從發酵培養基中取樣用2層紗布過濾，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，所得上清液為粗酶液。

1.2.5.2 測定酶活性。

①葡萄糖標準曲線的繪制：

取6支試管，編號，分別加入葡萄糖標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，蒸餾水1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL，向6支試管分別加入DNS試劑2.0 mL，沸水浴加熱5 min，冷卻后定容至120 mL，在540 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線[13]。

②濾紙酶活（FPase）的測定：

參見劉爽的方法[11]。③內切酶活力（CMCase）的測定：

參見劉爽的方法[11]。

設定每小時1 mL酶液催化1 μg的葡萄糖為1個酶活單位。

1.2.6 菌株的初步鑒定。

分別用插片培養法接種菌株孢子于高氏I號培養基中，培養5～7 d。用鑷子取出蓋玻片，輕輕擦去外側下部沾有的培養基，將其帶有菌絲的面向下，輕放于載玻片中央，在顯微鏡下觀察自然生長的菌株形態特征，及其基內菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的結構和顏色。根據菌株的菌落特征、菌絲及孢子顯微攝影圖片對菌株進行初步鑒定。

2 結果與分析

2.1 富集培養結果

共得到16種不同形態的菌株，分別命名為WZ1～WZ16。

2.2 初篩結果

用剛果紅染液對16種菌株進行染色，挑出具有明顯透明圈的菌落，測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），計算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。由表1可知，透明圈較大的4株菌透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）由大到小依次為WZ14、WZ12、WZ16、WZ15。

2.3 復篩結果

由表2可知，WZ15號菌株在初篩中D/d值最小，復篩中濾紙崩解情況最差，5 d濾紙條才碎裂成大塊，與另外3種菌株差距較大，WZ15被淘汰，而WZ12、WZ14、WZ16號菌株在復篩中結果相似，繼續進行后續的發酵試驗。

2.4 粗酶活性測定結果

2.4.1 葡萄糖標準曲線。

由圖1可知，葡萄糖的標準曲線是y=1.276 9x，R2為0.999 1，符合數據統計的標準。

2.4.2 纖維素酶活性測定結果。

由圖2可知，各菌株濾紙酶活性大小順序是WZ16、WZ12、WZ14，CMC酶活性大小順序是WZ14、WZ12、WZ16。而初篩時該3株菌透明圈大小順序是WZ14、WZ12、WZ16。

濾紙酶活性測定法不但可排除外切β1，4葡聚糖苷酶的干擾，而且可測定到具有真正纖維素分解能力的 Cx（內切β1，4葡聚糖酶）[14]。因此，以濾紙酶活性作為主要篩選標準，另外2種酶活性只作為參考。選出濾紙酶活性最大的菌株WZ16作為后續試驗的菌株，并對其進行菌種初步鑒定。

2.5 菌株初步鑒定結果

觀察菌株WZ16在固體平板上的形態特征，菌落較小、干燥、不透明，與培養基連接緊密，接種針不易挑取，表面有干粉狀孢子（圖3）。顯微鏡下觀察菌絲分為基質菌絲、氣生菌絲及孢子絲，孢子絲螺旋狀排列（圖4），參照《放線菌鑒定手冊》，初步鑒定菌株WZ16為一株鏈霉菌屬放線菌。

3 結論與討論

試驗最終篩選得到1株有較高纖維素酶活性的鏈霉菌屬放線菌菌株WZ16，但比較其初篩與復篩結果發現不完全一致，主要是由于剛果紅染色和濾紙崩解都是定性試驗，只能找出具有降解纖維素能力的菌株，無法準確地定量計算試驗菌株降解纖維素的能力。只有測定試驗菌的纖維素酶活才能確定其降解能力的大小。在試驗中，經計算WZ16的酶活最大，經72 h培養后，濾紙酶活為620 U，CMC酶活為72 U，與灰略紅鏈霉菌 C5相比[15]，濾紙酶活高出12.7%，CMC酶活低91.8%，由此可見，WZ16濾紙酶活較高，但CMC酶活很低，這很可能影響降解秸稈的速度。對此，可采用復合菌系[16]，將幾種降解秸稈纖維素的菌株混合培養，利用它們對纖維素不同的降解能力產生不同種類的纖維素酶，做到快速高效降解秸稈。

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