小球藻生長及關鍵營養元素代謝規律的研究

紀旭艷 李榮貴 郭欣 黃青山

摘要[目的]探索小球藻生長過程中關鍵營養元素代謝的基本規律，優化小球藻大規模培養工藝。[方法]以新型、高效的平板氣升環流式光生物反應器為模式反應器培養小球藻，定時檢測均勻鼓泡流下小球藻的生長狀況和培養液中氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵等關鍵營養元素的濃度。[結果]小球藻在264 h內的干重濃度接近線性增加趨勢；鐵元素在48 h后幾乎消耗殆盡；氮和磷元素在168 h后降至較低水平；鎂和鈣元素在96 h降至較低水平后不再明顯下降；鉀元素雖然是小球藻生長的重要組成元素，但其濃度始終處于波動狀態，變化并不顯著。[結論]小球藻的元素代謝主要發生在168 h前，各種元素的代謝速率有顯著差異；生長后期雖然大多數營養元素比較缺乏，但在持續光照和通入足夠二氧化碳的條件下小球藻仍然可以繼續生長一段時間。

關鍵詞 二氧化碳；小球藻；元素代謝；平板氣升環流式光生物反應器；均勻鼓泡流

中圖分類號 S968.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-001-04

Abstract[Objective]The aim was to explore the basic law of key elements metabolism in the growth process of Chlorella vulgaris， and optimize the largesclae cultivation process.[Method]A new and highefficient rectangular airlift loop photobioreactor was employed to produce Chlorella vulgaris， and the concentration curves of the key elements in the culture including N， P， K， Ca， Mg and Fe were measured every day during the cultivation to investigate the metabolic laws under the bubbly flow condition.[Result]The results indicated that the concentration of biomass based on the dry weight increases nearly linearly. The concentration of iron was depleted within 48 hours； Nitrogen and phosphorus dropped to a very low concentration after 168 hours. The concentration of magnesium and calcium were no longer declining after 96 hours， while the concentration of potassium kept unchanged. Nitrogen， phosphorus， magnesium， calcium and iron were essential elements for the growth of Chlorella vulgaris， but potassium was not necessary to be kept with a high concentration.[Conclusion]Most of the key elements are depleted in 168 h， and different element consumption rates are obtained. Although the lack of nutrients at last， the Chlorella vulgaris keeps growing by adding gas with sufficient CO2 and keeping illumination continuously in a limited period.

Key words Carbon dioxide； Chlorella vulgaris； Element metabolism； Rectangular airlift loop photobioreactor； Bubbly flow

小球藻是一類水生單細胞微藻，生長迅速，易于養殖，具有含油率高、蛋白質含量豐富、可凈化水質和空氣等優點[1]，因此被廣泛應用于污水凈化[2-3]、生物燃料[4]、醫藥保健、飼料等領域[5]，可進行異養生長和自養生長。異養培養的小球藻雖然可以達到較高的生長密度[6-7]，但其缺點也較多，如成本過高、容易染菌等[8]。自養培養的小球藻雖然生長濃度較低，但通過改變光照、溫度、培養液組分等條件[9-12]，也能達到較高的生物量濃度。隨著小球藻的生長，培養液中的關鍵營養元素會被逐漸消耗掉，而這些元素對小球藻的生長有不同的生理作用。Gorain等[13]研究表明鈣元素的缺乏和鎂元素的增加，有助于小球藻脂質的積累。Griffiths等[14]和Chu等[15]研究也發現氮元素的缺乏雖然會降低小球藻的生長速率，但可以增加脂質的含量。Concas等[16]研究表明適量增加鐵元素濃度對小球藻的生長速率和脂質含量均有增大的作用。Xu等[17]報道改變培養液中的碳氮元素比例可以影響磷元素的吸收，當碳氮比為6∶1時小球藻對磷元素的吸收率最高。總體而言，已有大量研究注重于部分營養元素對最終產物的調控，而關于關鍵營養元素代謝對小球藻生長的影響研究缺少全面、系統性的研究，而這是目前大幅度提高小球藻生物量產率的關鍵。

在實際的小球藻培養中，如果起初加入太多的營養元素，則會因為培養液鹽度過高而抑制小球藻的生長；在生長過程中，隨著培養液中關鍵營養元素的不斷消耗，小球藻的生長會由于某些元素的缺乏而生長變緩。因此，總結出小球藻的關鍵營養元素代謝規律，以此來對培養液進行適時補充或改變，對于實現小球藻高密度培養、脂質和蛋白質的積累具有重要意義，也是最簡單易行的辦法。筆者在一種高效的平板氣升環流式光生物反應器中培養小球藻[18]，探索小球藻生長過程中一些關鍵營養元素的代謝規律，旨在優化小球藻的培養工藝，從而提高其產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。硝酸鈉、碳酸鈉、氯化鈣、七水硫酸鎂、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鉀、硼酸、五水硫酸銅、二水合鉬酸鈉、四水合氯化錳、七水硫酸鋅、六水硝酸鈷、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸亞鐵、鉬酸銨、六水氯化鈷、過硫酸鉀、氫氧化鈉、硫酸亞鐵銨、氯化銨、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、鹽酸、剛果紅、鹽酸羥胺、冰乙酸、乙酸銨、鄰菲啰啉、硫酸、鈣指示劑、鉻黑T、無水乙醇、25%氨水、抗壞血酸、酒石酸銻鉀、四苯硼鈉、酚酞、5%次氯酸鈉溶液；2%二氧化碳和空氣的混合氣。

1.1.2 藻種。小球藻來自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。

1.1.3 培養基。試驗使用2種培養基，小球藻藻種的培養使用BG11培養基[18]，擴大培養和平板氣升環流式光生物反應器中的培養使用改良的培養基，其配方如下：1 g/L 硝酸鉀、66.45 mg/L 氯化鈣、237 mg/L磷酸二氫鉀、30 mg/L七水硫酸亞鐵、40 mg/L乙二胺四乙酸二鈉、204 mg/L七水硫酸鎂、1 mL/L重金屬離子溶液。重金屬離子溶液配方為：083 g/L 硼酸、0.95 g/L五水硫酸銅、0.17 g/L 鉬酸銨、3.3 g/L 四水合氯化錳、2.7 g/L 七水硫酸鋅、0.51 g/L六水氯化鈷。

1.1.4 儀器與耗材。1 L錐形瓶培養；1 L的管式反應器；14 L的柱式反應器；45 L的平板氣升環流式光生物反應器；36 W日光燈[18]。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培養。小球藻的培養過程包括藻種培養、擴大培養和在平板氣升環流式光生物反應器內的培養。所有的試驗裝置均使用次氯酸鈉浸泡殺菌，培養基在使用前均進行高溫、高壓滅菌處理。

①藻種培養。使用BG11培養基，使用1 L的錐形瓶，置于日光燈下培養，定期搖勻。

②小球藻的擴大培養。使用改良的培養基，使用1 L的管式反應器和14 L的柱式反應器，并持續通入含2%CO2的空氣混合氣，置于日光燈下培養。

③小球藻的最終培養在平板氣升環流式光生物反應器中。使用改良的培養基，培養基濃度為基準使用量的2倍，并持續通入空氣與純CO2混合均勻曝氣，空氣流量為150 L/h，CO2流量為51 mL/min，培養時間約為264 h，每天取樣1次，檢測小球藻的生長狀況和培養液中的鉀、鈣、鎂、氮、磷、鐵元素的濃度變化。

1.2.2 元素分析和小球藻生物量檢測。小球藻的生物量采取抽濾、烘干、稱重的辦法進行檢測，準備已稱重、孔徑0.44 μm的微孔濾膜，根據藻液濃度定量抽濾10～100 mL的藻液，并將留有小球藻的濾膜置于恒溫干燥箱內24 h后稱重，根據前后重量差來計算每次平行取樣藻液的生物量干重濃度，然后取多次取樣的均值作為平均濃度，將抽濾后的澄清溶液進行元素分析。鉀元素濃度使用四苯硼酸鉀重量法[19]測定，鈣和鎂元素濃度使用EDTA滴定法[20]測定，氮元素濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[21]測定，磷元素濃度采用鉬酸銨分光光度法[22]測定，鐵元素濃度使用鄰菲啰啉分光光度法[23]測定。

2 結果與分析

2.1 小球藻的生物量變化

從圖1可以看出，試驗中控制小球藻的接種濃度約為0.2 g/L，經過264 h的培養，小球藻的干重的變化趨勢近似線性增加。總體來看，前期增長速度略快，后期增長速度略微緩慢，小球藻的最終濃度在4.5 g/L左右，比初始濃度增加了大約22倍，生物量積累速率約為04 g/（L·d）。由于該試驗使用的日光燈光強較弱，約為120 μmol/（m2·s），隨著藻液濃度的增大，光穿透力僅有幾毫米，光成為限制小球藻快速生長的主要因素。因此，試驗中并未明顯觀察到小球藻的指數生長期，而是呈持續近似線性增長。

2.2 關鍵元素濃度的變化

從圖2和圖3可以看出，氮和磷2種元素的代謝規律基本相似，196 h以前2種元素的濃度都快速下降，而在196～264 h達到極低水平，小球藻無法繼續攝取利用，因此其濃度基本不再變化，此時的氮濃度約為5.0 mg/L，而磷濃度約為15 mg/L，氮和磷的吸收率分別達到97%和83%以上。196 h后，雖然2種元素的濃度不再下降，在氮磷元素短缺的情況下，持續通入CO2補充碳源，生物量仍然在繼續增加，小球藻仍然可以繼續生長72 h以上。

從圖4可以看出，培養液中的鉀濃度并未呈現出下降的趨勢，整體處于小幅波動的狀態。這可能是由于鉀元素只是小球藻攝取、排出來維持滲透壓的一種元素，在小球藻的內外進行周期循環，但其并不是構成小球藻的重要元素。因此，在培養過程中不需要進行鉀元素的額外補充。

從圖5和圖6可以看出，鈣元素整體呈下降趨勢，96 h下降到較低的濃度，96 h后僅有小幅度下降，最終濃度約為30 mg/L，此濃度大約為小球藻可以攝取與利用的臨界值。鎂元素的代謝規律與鈣元素相似，前期濃度快速下降，大約在96 h后鎂濃度處于波動狀態，鎂濃度幾乎不變。據此推測，當鎂濃度低于30 mg/L時，小球藻同樣不能攝取與利用該元素。

從圖7可以看出，與前幾種元素相比，鐵濃度的下降尤為明顯和迅速。在前24 h鐵濃度急速下降到約3 mg/L，48 h下降到1 mg/L以下，48 h后下降非常緩慢，由于鐵濃度過低而無法繼續被小球藻攝取利用，因此鐵濃度基本不再變化，但小球藻的生長速率也未見明顯降低。

2.3 試驗干擾因素分析

對元素代謝規律的研究，試驗使用的是間接測量培養液中剩余元素的濃度來分析小球藻對各種元素的吸收與利用規律，而元素可能會有其他一些損失途徑（如生產沉淀、揮發等）。根據培養基配方可知，培養液中的氮源主要以硝酸根的形式存在，僅有不到0.1%的氮是以銨根形式存在，極少量的氮可能會以氨揮發和反硝化途徑損耗。鉀離子本身不會與其他離子生成沉淀，也不會揮發掉。鈣、鎂和亞鐵離子的沉淀pH分別為9.5、10.5和7.6，而該試驗中測得的初始pH為6.5左右，大約96 h后上升到76左右，最終pH不超過8.2，達不到鈣鎂離子沉淀的條件。96 h后雖然能達到亞鐵離子沉淀的pH，但鐵元素代謝主要發生在48 h前，96 h后并無明顯變化，而且培養基中的亞鐵離子與EDTA形成穩定的絡合物，不易形成沉淀。因此，鈣、鎂和鐵離子不會有沉淀損失。在小球藻干重測量時，理論上也不會摻雜這些元素的沉淀物對結果產生影響。

為了進一步驗證上述結果，該試驗設置了1個空白對照組：在1個1 L的大試管中，加入水和培養基，并持續通入CO2，8 h后取100 mL溶液進行抽濾、烘干測定，結果表明溶液中的不溶性物質僅有約15 mg/L，而小球藻1 d后干重就超過0.8 g/L，不溶物僅占小球藻干重的1%左右，對試驗結果影響不大。培養液中溶解的鈣、鐵、鎂、鉀等礦物質元素濃度遠大于沉淀物的濃度，而沉淀物的大部分又是水中原有的沙粒等物質，因此沉淀物中可能僅有極微量的部分是由培養液中的無機鹽沉淀所致。此外，這些無機鹽的沉淀作用也僅會發生在前期，并不會影響后期元素變化的趨勢。因此，可以認為培養液中的營養元素的消耗絕大部分是被小球藻吸收利用。

3 討論

3.1 小球藻的生物量

該試驗使用高效的平板氣升式環流式光生物反應器，小球藻的產量和產率要比一些常規的培養方式高很多。嚴佳琦等[24]研究表明光合自養的小球藻7 d產量達到0.92 g/L，僅達到該試驗培養3 d產量的60%。Wang等[25]使用鼓泡塔光生物反應器培養小球藻，小球藻的生物量產率為31.55 mg/（L·d），僅達到該試驗產率的8%左右。如果后期對營養元素進行適當補充，并且適量增加光照強度，該試驗預期可以達到更高的生物量和產率。

3.2 關鍵元素濃度變化

（1）氮和磷元素的濃度下降較快，由于氮和磷元素都是影響小球藻生長的關鍵營養元素，也是污染環境、造成水華等現象的主要元素，而小球藻對氮和磷元素具有高去除率的特點，如果應用在污水處理方面，不僅能凈化水源，還可以節約培養成本。呂本松等[8]研究表明氮元素和磷元素對促進小球藻生物量積累的協同作用與2種元素的配比有關，當小球藻培養液中的氮磷比為15∶1～16∶1時小球藻的生物量積累最高。該試驗的初始氮磷比為2.65∶1，隨著消耗，后期氮磷比為1∶3。因此，可以適當提高培養基初始濃度中的氮磷比，將更有利于小球藻的快速生長。

（2）鉀元素濃度基本不變，其不被小球藻吸收利用，僅在細胞內外周期循環，可能與調節小球藻的滲透壓有關。此外，鉀元素可能還有維持酶的活性、調控基因表達等作用。

（3）鈣、鎂元素的代謝主要發生在前期，在96 h后2種元素的濃度降到約30 mg/L，后期由于鈣、鎂濃度低導致小球藻無法攝取與利用，因此鈣、鎂濃度幾乎不再變化。已有研究表明，在小球藻的生長過程中減少鈣元素的供應、數倍增加鎂元素的供應，均有利于小球藻內脂質的積累[13]，缺鎂脅迫下小球藻的脂質積累得到了提高，生長速率、光合活性和光合色素都有明顯下降[26]。因此，在特定時期對鈣和鎂元素濃度進行調整，可以促進小球藻目標產物的提高。

（4）鐵元素代謝速率尤為迅速，在48 h內初始濃度由10 mg/L降到1 mg/L以下，此后幾乎不再下降，但并不影響小球藻生物量的繼續增加。這是由于鐵元素的濃度影響小球藻脂質的積累，補充足量的鐵元素可以增加小球藻的產油率[16]，其對小球藻生長速率的影響卻不大[27]。駱科柩[28]試驗也表明鐵濃度會影響到小球藻對磷元素的吸收，鐵磷元素的比例則會影響到小球藻的生長速率，當鐵磷比為0.7時小球藻可以達到較高的比生長速率。該試驗中鐵磷元素的初始比為0.12，鐵磷元素比例較低。因此，在實際的營養元素補充時，除了適時、適量地添加營養元素以外，還應注意維持各元素之間的比例平衡，才能保證小球藻的高速生長和目標產物的積累。

4 結論

該試驗中小球藻在264 h的生長過程中生物量干重接近線性增加，而關鍵營養元素的代謝規律各不相同。氮和磷元素的代謝發生在前168 h，鈣和鎂元素的代謝發生在前72 h，鐵元素的代謝發生在前48 h，而鉀元素濃度全程處于波動狀態并未下降。在培養168 h后，培養液中的關鍵營養元素幾乎耗盡，其濃度也不再下降。此時，若繼續通入CO2，小球藻仍然可以在充足光照和CO2條件下進行有限時間段的生物量積累直至死亡。

參考文獻

[1]PRAVEENKUMA R，KIM B，CHOI E，et al.Mixotrophic cultivation of oleaginous Chlorella sp.KR1 mediated by actual coalfired flue gas for biodiesel production[J].Bioprocess and biosystems engineering，2014，37：2083-2094.

[2]CHAN A，SALSALI H，MCBEAN E.Heavy metal removal（copper and zinc）in secondary effluent from wastewater treatment plants by microalgae[J].ACS sustainable chemistry & engineering，2014，2：130-137.

[3]EBRAHIMIAN A，KARIMINIA H R，VOSOUGHI M.Lipid production in mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris in a mixture of primary and secondary municipal wastewater[J].Renewable energy，2014，71：502-508.

[4]AHMAD A L，YASIN N H M，DEREK C J C，et al.Comparison of harvesting methods for microalgae Chlorella sp.and its potential use as a biodiesel feedstock[J].Environmental technology，2014，35（17）：2244-2253.

[5]SAFI C，ZEBIB B，MERAH O，et al.Morphology composition production processing and applications of Chlorella vulgaris：A review[J].Renewable and sustainable energy reviews，2014，35：265-278.

[6]邢翔，張小葵，杜宗軍，等.兩種生物反應器高密度培養小球藻研究[J].科技導報，2008，26（23）：56-58.

[7]李金穗，汪蘋，董黎明.小球藻高密度培養及油脂提取條件的優化[J].微生物學通報，2012，39（4）：486-494.

[8]呂本松，苗玉成，張磊，等.小球藻養殖技術的研究[J].鹽業與化工，2013，42（9）：16-19.

[9]歐陽崢嶸，溫小斌，耿亞紅，等.光照強度、溫度、pH、鹽度對小球藻（Chlorella）光合作用的影響[J].武漢植物學研究，2010，28（1）：49-55.

[10]KIM D G，LEE C，PARK S M，et al.Manipulation of light wavelength at appropriate growth stage to enhance biomass productivity and fatty acid methyl ester yield using Chlorella vulgaris [J].Bioresource technology，2014，159：240-248.

[11]PARK W K，MOON M，KWAK M S，et al.Use of orange peel extract for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris：Increased production of biomass and FAMEs[J].Bioresource technology，2014，171：343-349.

[12]于貞，王長海.小球藻培養條件的研究[J].煙臺大學學報，2005，18（3）：206-210.

[13]GORAIN P C，BAGCHI S K，MALLICK N，et al.Effects of calcium，magnesium and sodium chloride in enhancing lipid accumulation in two green microalgae[J].Environmental technology，2013，34（13/14）：1887-1894.

[14]GRIFFITHS M J，HILLE R P，HARRISON S T L.The effect of nitrogen limitation on lipid productivity and cell composition in Chlorella vulgaris[J].Applied microbiology and biotechnology，2014，98：2345-2356.

[15]CHU F F，CHU N P，CAI P J，et al.Phosphorus plays an important role in enhancing biodiesel productivity of Chlorella vulgaris under nitrogen deficiency[J].Bioresource technology，2013，134：341-346.

[16]CONCAS A，STERITI A，PISU M，et al.Comprehensive modeling and investigation of the effect of iron on the growth rate and lipid accumulation of Chlorella vulgaris cultured in batch photobioreactors[J].Bioresource technology，2014，153：340-350.

[17]XU B，CHENG P，YAN C，et al.The effect of varying LED light sources and influent carbon/nitrogen ratios on treatment of synthetic sanitary sewage using Chlorella vulgaris[J].World journal of microbiology and biotechnology，2013，29：1289-1300.

[18]郭欣.平板氣升環流式光生物反應器內流體力學、傳質及營養元素代謝的研究[D].青島：青島科技大學，2014.

[19]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.復混肥料中鉀含量的測定四苯硼酸鉀重量法：GB/T 8574—2010[S].北京：中國標準出版社，2011.

[20]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.制鹽工業通用試驗方法鈣和鎂的測定：GB/T 13025.6—2012[S].北京：中國環境科學出版社，2012.

[21]環境保護部.水質總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法：HJ 636—2012[S].北京：中國環境科學出版社，2012.

[22]國家環境保護局.水質總磷的測定鉬酸銨分光光度法：GB 11893—89[S].北京：中國標準出版社，1989.

[23]國家環境保護總局.水質鐵的測定鄰菲啰啉分光光度法：HJ/T 345—2007[S].北京：中國標準出版社，2007.

[24]嚴佳琦，黃旭雄，黃征征，等.營養方式對小球藻生長性能及營養價值的影響[J].漁業科學進展，2011，32（4）：77-85.

[25]WANG S K，HU Y R，WANG F，et al.Scaleup cultivation of Chlorella ellipsoidea from indoor to outdoor in bubble column bioreactors[J].Bioresource technology，2014，156：117-122.

[26]王珊，趙樹欣，魏長龍，等.缺鎂脅迫對普通小球藻光合生理及油脂積累的影響[J].環境科學，2014，35（4）：1462-1467.

[27]王輝，陳來喜，肖愛鳳，等.氮和鐵對小球藻和微擬球藻油脂積累的影響[J].海南師范大學學報，2012，25（1）：86-89.

[28]駱科柩.淡水藻類對磷、鐵的協同吸收及增殖過程研究[D].廣州：廣東工業大學，2015.