一株海綿附生芽孢桿菌的抗硅藻附著活性成分的分離鑒定

吳 珊, 俞思羽, 姜 薇, 2, 張立奎, 2, 靳翠麗, 2, 周曉見, 2

?

一株海綿附生芽孢桿菌的抗硅藻附著活性成分的分離鑒定

吳 珊1, 俞思羽1, 姜 薇1, 2, 張立奎1, 2, 靳翠麗1, 2, 周曉見1, 2

(1. 揚州大學環境科學與工程學院, 江蘇揚州 225127; 2. 揚州大學海洋科學與技術研究所, 江蘇揚州 225127)

為尋找天然抗污損活性化合物, 以抗硅藻附著活性為導向, 采用有機溶劑萃取、半制備高壓液相色譜對分離自海綿的芽孢桿菌UST050418-715代謝產物進行分離, 純化抗硅藻附著活性物質, 并利用氣相色譜-質譜聯用儀、核磁共振波譜分析活性物質結構。從菌株UST050418-715代謝產物中分離得到7種具有抗硅藻附著活性的環二肽類化合物, 分別鑒定為: (1)環(L-亮氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-)、(2)環(L-纈氨酸-L-脯氨酸)、(3)環(D-脯氨酸-L-亮氨酸)、(4)環(L-脯氨酸-D-亮氨酸)、(5)環(甘氨酸-L-脯氨酸)、(6)環(L-苯丙氨酸-順式-8-羥基-D-脯氨酸-)、(7)環(L-苯丙氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-)。說明海綿附生芽孢桿菌UST050418-715代謝產物中存在大量環二肽類化合物, 可以幫助宿主海綿實現對硅藻附著的化學防御。

抗硅藻附著; 芽孢桿菌; UST050418-715; 環二肽

海洋生物污損一直是亟待解決的一個問題, 在全球范圍內給人類造成巨大的經濟損失[1]。海洋污損生物是指棲息、附著及生長在船舶和各類人工設施上給海洋開發活動帶來負效益的動物、植物、微生物的總稱[2]。其中, 海洋硅藻是海洋生物污損過程的初始附著生物之一, 具有種類多、數量大、繁殖快等特點, 其在水下固相表面的附著可誘導后期藤壺、貝類以及無脊椎動物等大型污損生物的附著生長; 形成復雜的污損生態群落, 加速金屬的腐蝕、影響設備的正常使用, 影響水產養殖業的產量和質量[3-5]。所以, 抑制海洋硅藻的附著, 可以推遲或阻止大型污損生物的附著, 對海洋生物污損的防治起著至關重要的作用。

針對海洋生物污損, 人們探索多種防污方法, 如防污涂料涂裝法、超聲波振動法、氯氣注入法、海水電解法、銅-鎳合金粘貼法、海水間歇加熱法、低表面自由能材料粘貼法等[6]。其中, 防污涂料技術成熟、工藝簡單, 通過化學防污劑的受控釋放, 阻止海洋生物在物體表面的附著, 是應用最廣泛的方法[7]。20世紀70年代起使用的有機錫、氧化亞銅及合成的殺蟲劑等防污劑, 是通過毒殺附著生物達到防污目的。由于這些傳統防污劑對非目標生物也有嚴重的毒性, 對海洋生態造成其不可恢復的損傷,因而于20世紀80年代末相繼被禁用或限用[8]。近年來, 隨著天然產物化學的發展, 海洋天然防污劑以其無毒的防污作用引起了人們注意[9]。海洋天然防污劑是指從一些海洋生物如紅藻、珊瑚、海綿等生物體中提取的具有防污活性的天然物質, 目前已報道的物質包括有機酸、內酯、萜類、甾醇類、環二肽類和吲哚類等; 它們降解速度快, 且不危害海洋生物的生命, 有利于保持生態平衡[8, 10-11]。因此, 尋找海洋天然防污損化合物已成為獲得高效、無毒、環境友好型防污劑的重要途徑之一。

海洋植物(如紅藻、褐藻等)、海洋動物(如珊瑚、海綿等)是海洋天然抗污損物質的良好來源, 但由于生長期長、規模化培養條件高等原因, 難以滿足商業規模化生產需要[12]。相比較而言, 海洋微生物(細菌、真菌等)容易大規模培養, 生長周期短, 更具有優勢和發展潛力[10, 13-14]。海綿以其復雜的孔狀結構和濾食系統成為海洋微生物的天然宿主, 其體內微生物的密度高達109個/mL。越來越多的研究證實, 海綿中分離到的活性物質, 其真正來源是共附生的海洋微生物[15-16]。而固著生長的海綿具有化學防御機制, 不會受到污損生物的附著。因此, 海綿共附生微生物在其化學防御中的作用以及從其共附生微生物中尋找天然防污損化合物, 成為目前研究新熱點[17-20]。Kon-ya等[21]從海綿中分離出的細菌sp.的培養液中提取出了泛酶-8, 能有效抑制紋藤壺附著。朱建生等[22]從海綿sp.附生菌中提取出了具有抗硅藻附著活性的環(苯丙氨酸-丙氨酸)和環(丙氨酸-色氨酸)等環二肽類化合物。本課題組前期從海綿共附生微生物藻種庫中篩選到一株抗硅藻附著的芽孢桿菌UST050418-715, 并發現該菌株對小新月菱形藻、咖啡雙眉藻、碎片菱形藻等多種硅藻的附著現象都有較為明顯的抑制效果[12, 23]。

本研究以抗硅藻附著活性為導向, 對該菌株代謝產物中的抗硅藻附著活性組分進行分離純化, 并鑒定其化學結構, 為海綿共附生芽孢桿菌作為天然抗污損活性物質來源做一嘗試。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養基

試驗菌株UST050418-715由香港科技大學海岸海洋實驗室錢培元教授課題組提供, 從采集于美國華盛頓州圣璜島附近海域48.55°N, 123.01°W的海綿樣品中分離[12, 23]。該菌株經本實驗室鑒定為短小芽孢桿菌()。

培養基配方為: 蛋白胨7.5 g/L, 酵母粉3.0 g/L、NaCl 10.45 g/L、MgCl25.90 g/L、MgSO4·7H2O 3.24 g/L、CaCl21.80 g/L、KCl 0.55 g/L、檸檬酸鐵0.10 g/L, pH為9.5。瓊脂培養基: 在以上配方中加入瓊脂15~20 g/L。

1.2 菌株UST050418-715粗提物的制備

按朱建生等[23](2013)的方法培養和發酵菌株。在發酵產物中加入等體積的乙酸乙酯(含5 %丙酮)進行震蕩萃取分離, 收集上層有機相, 萃取三次; 萃取液在37℃水浴下減壓濃縮后, 移入小離心管, 用冷凍離心濃縮儀凍干, 4℃避光保存[23-24]。

1.3 抗硅藻附著活性測試

測試硅藻為小新月菱形藻(), 由中國海洋大學水產學院藻種室提供。硅藻采用f/2培養液[25]。

將離心后的硅藻經人工海水洗滌, 調整密度后和待測樣品在24孔板上混合, 使樣品的最終測試濃度均為100mg/mL。經24 h光照培養后, 注入人工海水洗滌。最后, 于顯微鏡下觀察孔底附著的硅藻數量。具體測試方法按照靳翠麗(2015)方法進行[23]。

抑制率計算公式:

1.4 抗硅藻活性物質的分離純化

將UST050418-715菌株進行批量發酵, 共120 L, 萃取、蒸餾得到13 g粗提物。將其溶于甲醇進行離心(轉速2000??r/min)去除無機鹽, 取上清液蒸干得到粗提物10.5 g。在蒸干的粗提物中加入100 mL 的純水, 用玻璃棒攪拌, 并用超聲在30℃下溶解。用等體積的石油醚萃取3次, 收集石油醚相; 再用等體積的二氯甲烷萃取3次, 收集二氯甲烷相; 之后用等體積的乙酸乙酯萃取3次, 收集乙酸乙酯相; 最后用等體積的正丁醇萃取3次, 分別收集正丁醇相和水相, 將以上收集到的五相用旋蒸儀濃縮蒸干, 4℃保存備用。

活性物質的半制備HPLC分離純化使用LabTech半制備HPLC, 色譜柱: C18(250 mm × 10 mm, 5 μm); 流速: 2 mL/min; UV檢測器檢測波長: 210 nm。樣品用甲醇溶解, 14 000 r/min離心5 min, 取上清液進樣。選取一定比例的甲醇水為流動相, 根據出峰的保留時間收集流出液。

1.5 抗硅藻活性物質的結構分析

GC-MS分析采用Thermo ITQ900系統, 配制的GC運行條件: 色譜柱為DB-VRX毛細管柱(60.0 m × 250 μm × 1.40 μm), 載氣為高純He, 進樣口溫度280℃, 10︰1分流進樣模式, 進樣量1 μL, 柱流速1 mL/min, 程序升溫, 起始溫度40℃, 保持3 min, 以10℃/min升到300℃, 保持5 min。MS運行條件: EI離子源, 離子源溫度為250℃, 質量掃描范圍為50~650 amu。

將5 mg左右真空干燥后的樣品, 溶于0.5 mL氘代DMSO中, 裝入核磁共振, 利用Bruker AVANCE 600核磁共振波譜儀在600 MHz下共振測量, 得到1H-NMR譜。利用Anton Paar MCP300 旋光儀測得化合物比旋光值。

2 結果與討論

2.1 有機溶劑萃取結果

按照極性從小到大的順序用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種有機溶劑對菌株UST050418- 715粗提物進行萃取, 得到石油醚相(Fr-1)、二氯甲烷相(Fr-2)、乙酸乙酯相(Fr-3)、正丁醇相(Fr-4)和水相(Fr-5)。

測定初分離各相的抗硅藻附著活性, 結果見圖1。由圖1可見, 5個組分對硅藻的附著均有抑制作用, 相對于極性中等和偏大的Fr-3、Fr-4和Fr-5, 極性偏小的Fr-1和Fr-2硅藻抑制活性更好, 說明活性主要集中在中偏小極性區。從質量分布來看, 二氯甲烷相Fr-2(質量占比41.7%)最大, 遠遠大于其他相, 而其他各相質量占比差異較小。因中等極性的片段分離難度小, 本研究選取抗硅藻附著活性最好和質量占比最大的二氯甲烷相Fr-2和極性中等的乙酸乙酯相Fr-3進行下一步的分離。

2.2 二氯甲烷相(Fr-2)的半制備HPLC分離

對中小極性片段二氯甲烷相Fr-2, 進行半制備HPLC的分離純化。其分離、純化流程圖如圖2所示。

通過半制備HPLC對Fr-2(二氯甲烷相)進行分離(MeOH-H2O=40%), 得到組分Fr-2.1~Fr-2.8, 其半制備高壓液相制備分離的保留時間截點圖見圖3。Fr-2.3、Fr-2.5從液相譜圖上看都是單峰且峰面積占比較大, 因此在出峰時將其從半峰高到峰頂的部分單獨接出, 就能得到相對較純的組分, 分別標記為Fr-2.3*、Fr-2.5*。在24孔板下測定Fr-2(二氯甲烷相)經半制備HPLC分離得到的Fr-2.1~Fr-2.8各組分的抗硅藻附著活性, 結果如圖4所示。

其中制備得到較純的組分Fr-2.3*(抑制率12.7%)、Fr-2.5*(抑制率-10%), 都沒有表現出顯著活性。而Fr-2.4(抑制率57%)、Fr-2.6(抑制率65.5%)、Fr-2.7(抑制率61.5%)、Fr-2.8(抑制率66.5%)都對硅藻表現出一定的抑制作用, 但是從其液相圖譜上看都不是單一組分, 因此對Fr-2.4、Fr-2.6、Fr-2.7進行進一步的半制備HPLC分離(MeOH-H2O=30%), Fr-2.8由于極性太小, 分離比較費時, 直接對其嘗試結構分析。

對Fr-2.4組分進行半制備HPLC分離, 得到6個組分分別記為Fr-2.4.1~Fr-2.4.6, 測定各組分抗硅藻附著活性, 發現Fr-2.4.1和Fr-2.4.5的活性相對較好, 抑制率分別為67%和39%。從半制備液相譜圖上看Fr-2.4.2、Fr-2.4.4、Fr-2.4.6均為單峰, Fr-2.4.3和Fr-2.4.5在半制備液相譜圖上看均有兩個峰, 成分相對簡單。

對Fr-2.6組分進行半制備HPLC分離, 得到6個組分分別記為Fr-2.6.1~Fr-2.6.6, 測定各組分抗硅藻附著活性, 發現Fr-2.6.2對硅藻有顯著的抑制活性, 抑制率達98%, Fr-2.6.1也有一定的抑藻活性, 抑制率為58.6%。其余組分沒有表現出明顯的抑制活性。從半制備液相譜圖上看, Fr-2.6.3組分較純呈單峰, Fr-2.6.4和Fr-2.6.5相對較純, 都有一個峰面積較大的主峰。活性最好的Fr-2.6.2液相譜圖并不是單峰, 有四個較大的峰, 進一步分離純化(MeOH-H2O=30%)得到4個組分記為Fr-2.6.2.1~Fr-2.6.2.4, 從其液相譜圖看來只有Fr-2.6.2.4的組分比較單一。活性其次的Fr-2.6.1, 從液相譜圖上看, 有三個較大的峰。

對Fr-2.7組分進行半制備HPLC分離, 得到3個組分分別記為Fr-2.7.1、Fr-2.7.2和Fr-2.7.3, 測定各組分抗硅藻附著活性, 發現Fr-2.7.2的活性相對較好, 抑制率為58%, 另外兩個組分沒有表現出明顯的抑藻活性。從半制備液相譜圖上看, Fr-2.7.1和Fr-2.7.3組分較純, 都呈單峰。而有一定抑藻活性的Fr-2.7.2其液相譜圖并不是單峰。

對以上經液相完成初步純化的組分進行結構分析。

2.3 乙酸乙酯相Fr-3的半制備HPLC分離

對中極性片段乙酸乙酯相Fr-3, 進行半制備HPLC的分離純化。其分離、純化流程圖見圖5。

*. 表示片段中較純的部分

*. indicates the purer portionof the fragment

通過半制備HPLC對Fr-3(乙酸乙酯相)進行制備分離(MeOH-H2O=40%), 得到組分Fr-3.1~ Fr-3.7, 其半制備高壓液相制備分離的保留時間截點圖見圖6。Fr-3.2、Fr-3.5、Fr-3.7從液相譜圖上看都是單峰且峰面積占比較大, 因此在出峰時將其從半峰高到峰頂的部分單獨接出, 就能得到相對較純的組分, 分別標記為Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.7*。

在24孔板下測定Fr-3(乙酸乙酯相)經半制備HPLC分離得到的Fr-3.1 ~ Fr-3.7各組分的抗硅藻附著活性, 結果如圖7所示。

其中制備得到較純的組分Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.6、Fr-3.7*中, Fr-3.7*(抑制率11.0%)活性很差, Fr-3.2*和Fr-3.5*抑制率分別為46.3%和30.7%, 但活性在重復測試中的穩定性不高。Fr-3.3(抑制率44.8%)是10個組分中活性相對最好且活性表現最穩定的組分, 因此對Fr-3.3進行進一步的半制備HPLC分離。

Fr-3.3的極性較大, 用10%的甲醇水對其進行半制備HPLC純化, 得到組分Fr-3.3.1~Fr-3.3.8, 測定各組分抗硅藻附著活性, 其中Fr-3.3.8的硅藻抑制活性最好, 抑制率高達90%, 液相譜圖上看組分單一, 且由于組分質量較少, 沒有進行更進一步的分離工作。

對以上經液相完成初步純化的組分進行結構分析。

2.4 抗硅藻活性化合物結構的分析鑒定

通過GC-MS對前面獲得的共計34個樣品進行測定, 說明其中共有12個樣品純度較高, 包括: Fr-2.1(101mg)、Fr-2.3*(244mg)、Fr-2.4.2(7.8mg)、Fr-2.4.3(5.7mg)、Fr-3.2*(62mg)、Fr-3.5*(295mg)、Fr-3.6(89mg)、Fr-3.7*(116mg)、Fr-2.6.5(16mg)、Fr-2.7.1(27mg)、Fr-2.7.2(3.7mg)、Fr-2.6.2.4(4mg)。12個組分的GC-MS分析結果見表1, 其中Fr-2.3*未測出結果, Fr-2.4.2、Fr-3.5*、Fr-3.6和Fr-3.7*未定出分子式。Fr-2.4.3、Fr-2.6.2.4、Fr-2.6.5、Fr-2.7.1、Fr-2.7.2的GC-MS測定結果分子質量都為210, Fr-2.4.2、Fr-3.5*的GC-MS測定結果分子量都為226, Fr-3.6和Fr-3.7*的GC-MS測定結果分子質量都為260, 推測它們可能是有不同的同分異構體。其他活性較好組分, 如Fr-2.8、Fr-2.6.2.1、Fr-2.6.2.2、Fr-2.6.2.3、Fr-3.3.5, 由其GC-MS譜圖來看成分純度不高, 難以推測其所含活性物質結構。

表1 12個組分的GC-MS分析結果

注: “—”代表未測出結果

根據GC-MS的初步分析, 選取上述12個較純的樣品進行1H-NMR波譜分析。樣品性狀和1H NMR分析結果如下:

Fr-2.3*、Fr-2.4.2、Fr-3.5*為白色粉末;- 102.3 (1.0, MeOH); 分子式: C11H18N2O3;1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH0.87 (3H, d,=6.5 Hz, H-13), 0.85 (3H, d,=6.5 Hz, H-12), 1.35 (1H, m, H-10b), 1.78(1H, m, H-10a), 1.87-1.93 (2H, overlap, H-7b, H-11), 2.03 (1H, m, H-7a), 3.23 (1H, d,=12.3 Hz, H-9a), 3.48 (1H, dd,=4.3, 12.3 Hz, H-9b), 3.49 (1H, m, H-6), 4.04 (1H, t,=6.0 Hz, H-3), 4.38 (1H, m, H-8), 5.08 (1H, brs, OH), 7.98 (1H, brs, 4-NH)。參照Liu H等2010年的文獻, 確定結構為環(L-亮氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-) [cyclo (L-leu-trans-8-hydroxy-L-pro)] (見圖8-化合物1)[15, 26]。

Fr-2.6.5為無色針晶; 分子式: C11H18N2O2;+ 89.2 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH0.89 (3H, d,=6.6 Hz, H-12), 0.91 (3H, d,=6.6 Hz, H-13), 1.45 (1H, m, H-10a), 1.56 (1H, m, H-11), 1.77-1.82 (4H, overlap, H-7a, H-8, H-10b), 2.14 (1H, m, H-7b), 3.33 (1H, m, H-9a), 3.34 (1H, m, H-9b), 3.60 (1H, m, H-3), 4.16 (1H, dd,=6.4, 1.5 Hz, H-6), 8.33 (1H, d,=3.2 Hz, 4-NH)。參照Adamczeski M等1999年以及朱建生2013年的文獻, 確定結構為環(D-脯氨酸-L-亮氨酸) [cyclo (D-pro-L-leu)](見圖8-化合物3)[15, 27, 29]。

Fr-2.7.1為無色針晶; 分子式: C11H18N2O2;– 81.5 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH0.87 (6H, overlap, H-12, H-13), 1.35 (1H, m, H-11), 1.76-1.87 (6H, overlap, H-7, H-8, H-10), 3.38 (2H, m, H-9), 4.00 (1H, m, H-3), 4.18 (1H, m, H-6), 7.98 (1H, brs, 4-NH)。將1H NMR數據與朱建生2013年以及劉濤等2009年的文獻對照, 確定結構為環(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[cyclo (L-pro-D-leu)] (見圖8-化合物4)[15, 29-30]。

Fr-3.2*為無色塊晶; 分子式: C7H10N2O2;– 98.2 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH1.78-1.87 (3H, overlap, H-7a, H-8), 2.13 (1H, m, H-7b), 3.33 (1H, m, H-9b), 3.41 (1H, m, H-9a), 3.51 (1H, dd,=4.5, 16.2 Hz, H-3a), 3.99 (1H, d,=16.2 Hz, H-3b), 4.12 (1H, dd,=6.0, 8.0 Hz, H-6), 8.05 (1H, brs, 4-NH)。將1H NMR數據與Liu H等2010年的文獻對照完全一致, 但是旋光值完全相反, 因而結構確定為環(甘氨酸-D-脯氨酸)的對應異構體, 為環(甘氨酸-L-脯氨酸) [cyclo (gly-L-pro)] (見圖8-化合物5)[15, 26]。

Fr-3.6呈無色油狀; 分子式: C14H16N2O3;+ 31.0 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH1.84 (1H, m, H-7a), 2.11 (1H, m, H-7b), 2.92 (1H, dd,=3.5, 15.0 Hz, H-10a), 3.02 (1H, dd,=5.0, 15.0 Hz, H-10b), 3.14 (2H, m, H-9), 3.45 (1H, dd,=3.5, 5.0 Hz, H-3), 3.97 (1H, m, H-6), 4.11 (1H, m, H-8), 5.00 (1H, brs, 5-OH), 7.26-7.30 (5H, overlap, H-11, 12, 13, 14, 15, 16), 8.13 (1H, brs, 4-NH)。參照朱建生2013年以及Shigemori 等1998年的文獻, 確定結構為環(L-苯丙氨酸-順式-8-羥基-D-脯氨酸-)[cyclo (L- phe-cis-8-hydroxy-D-pro)](見圖8-化合物6)[15, 29, 31]。

Fr-3.7*呈無色油狀; 分子式: C14H16N2O3;–35.9 (1.0, MeOH);1H NMR (600 MHz, DMSO-6): δH1.52 (1H, m, H-7a), 1.94 (1H, m, H-7b), 3.02 (1H, dd,=5.0, 15.0 Hz, H-10a), 3.06 (1H, dd,=5.4, 15.0 Hz, H-10b), 3.07 (1H, dd,=3.8, 12.0 Hz, H-9a), 3.13 (1H, overlap, H-9b), 4.19 (1H, t,=5.2, H-3), 4.31 (1H, dd,=6.2, 11.2 Hz, H-6), 4.39 (1H, m, H-8), 5.10 (1H, brs, OH), 7.19-7.29 (5H, overlap, H-12, 13, 14, 15, 16), 7.95 (1H, brs, 4-NH)。參照Liu 等2010年以及朱建生2013年的文獻, 確定結構為環(L-苯丙氨酸-反式- 8-羥基-L-脯氨酸-) [cyclo (L-phe-trans-8-hydroxy-L- pro)](見圖8-化合物7)[15, 26, 29]。

Fr-2.1、Fr-2.6.2.4、Fr-2.7.2樣品不純, 無法根據1H-NMR解析出結構。

綜上, 通過半制備HPLC對海綿附生芽孢桿菌UST050418-715代謝產物中具有抗硅藻附著活性的組分進行活性導向的分離純化, 并采用GC-MS和1H-NMR對分離得到的較純活性組分進行結構分析, 得到7種環二肽類化合物, 分別鑒定為:

(1) Fr-2.3*、Fr-2.4.2和Fr-3.5*的主要成分為同種物質, 均為環(L-亮氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-) [cyclo(L-leu-trans-8-hydroxy-L-pro)], 其抑制率最高達30.7%±5.0%;

(2) Fr-2.4.3的平面結構為環(L-纈氨酸-L-脯氨酸)[cyclo (L-val-L-pro)], 其抑制率為28.0%±10.4%;

(3) Fr-2.6.5為環(D-脯氨酸-L-亮氨酸)[cyclo (D-pro-L-leu)], 其抑制率為28.0%±12.6%;

(4) Fr-2.7.1為環(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[cyclo (L-pro-D-leu)], 其抑制率為18.0%±2.8%;

(5) Fr-3.2*為環(甘氨酸-L-脯氨酸)[cyclo (gly- L-pro)] , 其抑制率為46.3%±10.8%;

(6) Fr-3.6為環(L-苯丙氨酸-順式-8-羥基-D-脯氨酸-)[cyclo (L-phe-cis-8-hydroxy-D-pro)], 其抑制率為28.7%±11.3%;

(7) Fr-3.7*為環(L-苯丙氨酸-反式-8-羥基-L-脯氨酸-)[cyclo (L-phe-trans-8-hydroxy-L-pro)], 其抑制率為11%±5.5%。

3 討論

海洋生物污損一直是困擾人類的棘手難題, 現行的防污措施都只是臨時的, 沒有從根本上解決問題。開發高效、無毒、環境友好的活性化合物, 是目前國內外都比較看好的解決途徑。從海洋微生物中尋找這種環境友好的天然抗污損化合物是切實可行的, 我國在海洋微生物資源的開發方面, 起步較晚, 因此有很大的潛力和發展空間。

海綿其獨特的化學防御機制一般認為與其共附生微生物相關, 海綿附生微生物可產生具有顯著抗污損活性的次生代謝產物。本研究所采用的試驗菌株UST050418-715, 為海綿附生芽孢桿菌, 在前期研究中, 發現其對多種硅藻的附著都有較為明顯的抑制作用。本文以抗硅藻附著活性作為追蹤指標, 利用溶劑萃取和半制備HPLC相結合的手段, 從該活性菌株發酵產物中分離活性化合物。并通過結構鑒定, 得到7種環二肽類化合物, 對硅藻附著均有一定的抑制作用。這一結果和朱建生等從海綿附著菌中分離到多個具有抗硅藻活性的環二肽的報道相似[22]。說明環二肽在海綿附生微生物幫助宿主進行化學防御的過程中起重要作用。同時, 實驗中也發現, 活性隨著分離純化的深入有一定程度的丟失, 說明可能化合物間存在一定的協同效應。

環二肽類化合物廣泛存在于自然界中, 報道的活性不僅有抗污損, 還有抗菌、抗腫瘤、調節激素、抑制群體感應等廣泛的生物活性[32-33]。另外, 環二肽類化合物多樣性極高, 混合樣品間的協同效應存在的可能性也較大。因此將其作為海洋天然產物防污劑用于海洋生物防污具有較高的可能性和選擇性[32, 34-35]。

[1] Townsin R L. The ship hull fouling penalty [J]. Biofouling, 2003, 19: 9-15.

[2] 方芳, 嚴濤, 劉慶. 化學生態學在海洋污損生物防除中的應用[J]. 應用生態學報, 2005, 16(10): 1997- 2002. Fang Fang, Yan Tao, Liu Qing. Application of chemical ecology in controlling marine fouling organisms[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2005, 16(10): 1997-2002.

[3] Hoagland K D, Rosowski J R, Gretz M R, et al. Diatom extracellular polymeric substances: function, fine structure, chemistry and physiology[J]. Journal of Phycology, 1993, 29(5): 537-566.

[4] 李燕, 高亞輝, 李雪松, 等. 海洋硅藻附著研究進展[J]. 生命科學, 2008, 20(5): 768-772.Li Yan, Gao Yahui, Li Xuesong, et al. Research progress on marine diatom adhesion[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2008, 20(5): 768-772.

[5] 黃運濤, 彭喬. 海洋生物污損的防治方法及研究進展[J]. 全面腐蝕控制, 2004, 18(1): 3-5. Huang Yuntao, Peng Qiao. The Prevention Method and Research Development of Marine Fouling[J]. Total Corrosion Control, 2004, 18(1): 3-5.

[6] 張立俠. 防海生物污損技術初探[J]. 橡塑資源利用, 2006, 2(2): 7-12. Zhang Lixia. Preliminary study on marine antifouling techniques[J]. Rubber & Plastics Resources Utilization, 2006, 2(2): 7-12.

[7] 許鳳嶺, 劉升發, 侯保榮. 海洋生物污損研究進展[J]. 海洋湖沼通報, 2008, 1: 146-152. Xu Fengling, Liu Shengfa, Hou Baorong. Marine fouling and the protection[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2008, 1: 146-152.

[8] 安軍, 葉嘉, 陳雷, 等. 海洋生物防污損活性的研究進展[J]. 邯鄲學院學報, 2007, 17(3): 70-73. An Jun, Ye Jia, Chen Lei, et al. Progress in studies on antifouling activity of marine organism[J]. Journal of Handan College, 2007, 17(3): 70-73.

[9] 王毅, 張盾. 天然產物防污劑研究進展[J]. 中國腐蝕與防護學報, 2015, 35(1): 1-11. Wang Yi, Zhang Dun. Recent research progress of nature product as antifouling agents[J]. Journal of Chinese Society for Corrosion and Protection, 2015, 35(1): 1-11.

[10] 周世偉, 楊翠云, 夏傳海. 天然產物防除海洋污損生物的研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2011(1): 186-192. Zhou Shiwei, Yang Cuiyun, Xia Chuanhai. The prevention of marine fouling organisms by natural antifoulants a Review[J]. Natural Product Research and Development, 2011(1): 186-192.

[11] 劉超, 付玉彬, 鄭紀勇. 環境友好型防污劑及海洋防污涂料的研究進展[J]. 材料開發與應用, 2009(4): 69-74.Liu Chao, Fu Yubin, Zheng Jiyong. Review on environmental friendly biocides and marine antifouling coatings[J]. Development and Application of Materials, 2009(4): 69-74.

[12] 忻夏瑩, 靳翠麗, 周曉見. 抗硅藻附著活性細菌的篩選、鑒定與發酵條件優化[J]. 海洋科學, 2013, 37: 90-96. Xin Xiaying, Jin Cuili, Zhou Xiaojian. Screening, identification and fermentation conditions optimization of bacteria against diatom adhesion[J]. Marine Sciences, 2013, 37: 90-96.

[13] Armstrong E, Boyd K G, Burgess J G. Prevention of marine biofouling using natural compounds from marine organisms[J]. Biotechnology Annual Reviews, 2000, 6: 221-241.

[14] Dobretsov S, Dahms H U, Qian P Y. Inhibition of biofouling by marine microorganisms and their metabolites[J]. Biofouling, 2006, 22: 43-54.

[15] Fabbri D, Adamiano A, Falini G, et al. Analytical pyrolysis of dipeptides containing proline and amino acids with polar side chains. Novel 2, 5-diketopip-erazine markers in the pyrolysates of proteins[J]. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 2012, 95: 145-155.

[16] Luis S M, Ballesteros J, Gutierrez M. Antibacterial constituents from the octocoral-associated bacteriumsp.[J]. Revista Latinoamericana de Quimica, 2011, 39(1-2): 75-83.

[17] Dash S, Jin C L, Lee O O, et al. Antibacterial and antilarval-settlement potential and metabolite profiles of novel sponge-associated marine bacteria[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2009, 36: 1047-1056.

[18] Lee O O, Lau S C K, Tsoi M M Y, et al.sp. nov., a novel member of the family Flavobacteriaceae, isolated from the marine sponge[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2006, 56: 1795-1799.

[19] Lee O O, Tsoi M M Y, Li X C, et al.gen. nov., sp. nov., a novel halotolerant member of theisolated from the marine spongeat Friday Harbor, USA[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1919-1924.

[20] Qian P Y, Xu Y, Fusetani N. Natural products as antifouling compounds: recent progress and future perspectives[J]. Biofouling, 2010, 26: 223-234.

[21] Kon-ya K, Shimidzu N, Miki W, et al. Indole derivatives as potent inhibitors of larval settlement by the barnacle,.[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1994, 58: 2178-2181.

[22] 朱建生, 姜薇, 繆莉, 等. 海洋細菌中具有抗硅藻附著的活性成分[J]. 微生物學報, 2013, 53: 825-831.Zhu Jiansheng, Jiang Wei, Miao Li, et al. Anti-diatom compounds from marine bacterium.[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2013, 53: 825- 831.

[23] 靳翠麗. 海綿附生微生物對底棲硅藻附著性能的影響[D]. 揚州: 揚州大學, 2015. Jin Cuili. The effects of marine sponge-associated microorganisms on the adhesion performance of benthic diatoms[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2015.

[24] Yang L H. Antifouling compounds from the marine spongeand its associated microbes[D]. Hong Kong: Hong Kong University of Science and Technology, 2006.

[25] Wen Z Y, Chen F. Continuous cultivation of the diatom Nitzschia laevis for eicosapentaenoic acid production: physiological study and process optimization[J]. Biotechnology, 2002, 18(1): 21-28.

[26] Liu H, Chen J, Deng Z W, et al. Secondary metabolites from marine derived fungus[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2010, 19: 482-486.

[27] Adamczeski M, Reed A R, Crews P. New and known diketopiperazines from the Caribbean sponge,cf.[J].Journal of Natural Products, 1995 58(2): 201-208.

[28] 李益, 唐金山, 高昊, 等. 海洋放線菌sp.(No.69)抗MRSA活性成分研究[J]. 中國海洋藥物雜志, 2010, 29(5): 16-21. Li Yi, Tang Jinshan, Gao Hao, et al. Study of anti- MRSA bioactive constituents from a marine actinomycetessp.(No.69)[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2010, 29(5): 16-21.

[29] 朱建生. 海洋細菌中環二肽及其生物活性研究[D]. 揚州: 揚州大學, 2013. Zhu Jiansheng. The study of diketopiperazines from marine bacteriumand its biological activity[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2013.

[30] 劉濤, 李占林, 王宇, 等. 海洋細菌次級代謝產物的研究[J]. 中國海洋藥物雜志, 2009, 28(5): 1-6. Liu Tao, Li Zhanlin, Wang Yu, et al. Studies on the secondary metabolites from the marine bacteria[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2009, 28(5): 1-6.

[31] Shigemori H, Tenma M, Shimazaki K, et al. Three new metabolites from the marine yeast[J]. Journal of natural products, 1998, 61(5): 696-698.

[32] 周世寧, 林永成, 吳雄宇, 等. 海洋真菌與細菌發酵物中的環二肽[J]. 微生物學通報, 2002, 29(3): 59-62. Zhou Shining, Lin Yongcheng, Wu Xiongyu, et al. Cyclic dipertides from marine fungi and bacteria cultures[J]. Microbiology, 2002, 29(3): 59-62.

[33] Holden M T G, Chhabra S R, de Nys R, et al. Quorum-sensing cross talk: isolation and chemical characterization of cyclic dipeptides fromand other gram-negative bacteria[J]. Molecular Microbiology, 1999, 33: 1254-1266.

[34] 楊子娟, 向蘭, 邢杰, 等. 環二肽的研究進展[J]. 現代藥物與臨床, 2009, 24(2): 73-81. Yang Zijuan, Xiang Lan, Xing Jie, et al. Research advances in cyclic dipeptides[J]. Modern Pharmacy and Clinic, 2009, 24(2): 73-81.

[35] 劉華珍, 王嶽. 微生物產生的酶抑制劑[J]. 抗生素, 1983(01): 49-63. Liu Huazhen, Wang Yue. Enzyme inhibitors from microorganisms[J]. Antibiotics, 1983(01): 49-63.

Isolation and identification of active compounds inhibiting diatom settlements using sponge-associatedsp.

WU Shan1, YU Si-yu1, JIANG Wei1, 2, ZHANG Li-kui1, 2, JIN Cui-li1, 2, ZHOU Xiao-jian1, 2

(1. College of Environmental Science & Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China; 2. Marine Science & Technology Institute, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)Received：Oct. 10, 2015

antidiatom settlement;sp. ; UST050418-715; cyclic dipeptides

In order to search for natural antifouling compounds, the compounds inhibiting diatom settlements were purified from the metabolites of a sponge-associatedsp. UST050418-715 via purification of organic solvent extraction and semipreparative high-performance liquid chromatography (HPLC) using antidiatom- settlement assays. The structures of active compounds were analyzed via gas chromatography–mass spectroscopy (GC–MS) and1H nuclear magnetic resonance (NMR). Consequently, seven active cyclic dipeptides in addition to dozens of fractions were isolated and purified. The seven cyclic dipeptides were identified as (1) cyclo (L-leu-trans-8- hydroxy-L-pro), (2) cyclo (L-val-L-pro), (3) cyclo (D-pro-L-leu), (4) cyclo (L-pro-D-leu), (5) cyclo (gly-L-pro), (6)cyclo (L-phe-cis-8-hydroxy-D-pro), and (7) cyclo (L-phe-trans-8-hydroxy-L-pro). The results of this study indicate that multiple cyclic dipeptides exist in the metabolites of sponge-associatedsp. UST050418-715 and contribute to the host’s chemical defense.

P735

A

1000-3096(2016)07-0023-10

10.11759/hykx20151010003

2015-10-10;

2015-11-16;

國家自然科學基金資助項目(41306131, 41106113, 41271521); 教育部科學技術研究重點項目資助項目(211065); 江蘇省自然科學基金項目(BK2012267, BK20130440); 江蘇省教育廳高校自然科學基金資助項目(13KJB180029, 15KJB170020)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41306131, No. 41106113 and No. 41271521; Key Project of Chinese Ministry of Education, No. 211065; Natural Science Foundation Grant of Jiangsu Province, China, No. BK2012267 and No. BK20130440; Natural Science Foundation for College and University of Jiangsu Province, No. 13KJB180029 and No.15KJB170020]

吳珊, 山西晉中人, 碩士研究生, 研究方向: 環境科學, E-mail: 15298466716@163.com;周曉見,通信作者, 博士, 教授, E-mail: zhouxiaojian@yzu.edu.cn

(本文編輯: 康亦兼)