基于無標記的核酸適配體熒光生物傳感器檢測凝血酶

貴莉莉

(新鄉職業技術學院，河南　新鄉　453000)

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基于無標記的核酸適配體熒光生物傳感器檢測凝血酶

貴莉莉*

(新鄉職業技術學院，河南新鄉453000)

設計了一個簡單、通用、基于核酸適配體無標記的高敏感、高專一檢測凝血酶的熒光方法。以無標記凝血酶核酸適配體單鏈DNA為識別元素，PicoGreen染料傳導互補雙鏈的熒光信號。PicoGreen是一種不對稱菁，當其單獨存在時不產生熒光信號，而當其被吸附到互補的雙鏈DNA上時，可產生很強的熒光信號,但被吸附到單鏈DNA上時，卻無明顯的信號改變。基于該性質，將其用于凝血酶的檢測。該方法對凝血酶的響應線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-7mol/L，相關系數(r2)為0.99，檢出限為1.0×10-14mol/L。1.0×10-8mol/L兩種干擾物質(牛血清蛋白和細胞色素C)的存在不影響凝血酶的檢測，表明該方法對凝血酶具有非常好的專一性。該方法成功應用于對人血清樣品的檢測，其平均回收率為97%～102%。方法可簡單、靈敏、特異性地檢測凝血酶，有望用于醫學臨床診斷等領域。

核酸適配體；生物傳感器；熒光；凝血酶

凝血酶是一種普遍存在于哺乳動物體內的蛋白質，其相對分子質量為36.7 kDa，等電位點為7.05。凝血酶具有類似激素類的性質，它涉及到血栓的形成和血小板的活性。因此，凝血酶在許多心血管疾病診斷中起到非常重要的作用[1]，同時它被認為在炎癥和細胞壁的修復進程中起調節作用。血液中的凝血酶在pmol/L濃度范圍內即可與疾病有相關作用，如血管生成、腫瘤生長和轉移的診斷[2]，因此在痕量水平高靈敏度檢測凝血酶具有重要的意義[3]。

適配體[4-6]本質上是單鏈寡核苷酸片段，為單鏈DNA或RNA，可與靶分子高特異性、高親和力結合。適配體是在體外人工合成隨機寡核苷酸文庫，由指數級富集的配基系統進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選產生。適配子能與多種目標物質高特異性、高選擇性地結合[7]。而DNA的一些二級結構(如發夾、莖環、凸環、G-四面體等)可使核酸分子形成多種三維結構，成為與靶物質特定區域結合的基礎。目前生物分子檢測通常采用抗原抗體特異性識別模式，但由于受到抗體易失活、制備時間較長等因素的影響，其應用受到限制。相比之下，核酸適配體因具有高特異性、高親和力、靶分子廣、體外合成、易于修飾、穩定性好、可反復變性、復性的優點而被廣泛關注。

目前關于凝血酶的檢測方法有電化學法[8-9]、電化學發光法[10]、表面增強拉曼光譜法[11]、熒光法[12-14]等。這些檢測方法或儀器昂貴、操作復雜，或檢測范圍有限，易受環境影響，檢測靈敏度不高。而本文采用無標記的適配子熒光法檢測凝血酶，具有儀器操作簡單、靈敏度高、檢測范圍寬等優點。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

核酸適配體(5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3’)購自上海生工生物有限公司。染料PicoGreen購自北京美萊博醫學有限公司。凝血酶、牛血清蛋白和細胞色素C購于Sigma公司。Tris緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.4)，其中含0.001 mol/L MgCl2，0.001 mol/L CaCl2，0.14 mol/L NaCl和0.005 mol/L KCl。實驗用水為超純水(艾科浦公司生產的實驗室級超純水)。

F-4500熒光分光光度計(Hitach公司，日本)。

1.2實驗原理

PicoGreen試劑是一種非對稱的花青染料，當其單獨存在或者結合單鏈DNA時，不產生熒光信號；而當其結合雙螺旋DNA時，由于PicoGreen能特異性嵌入互補雙鏈DNA的小溝槽中，可產生比單獨結合單鏈DNA時高1 000倍的熒光信號[15-17]。本文據此設計了一個新穎、簡單的熒光適配體生物傳感器以檢測凝血酶，分子識別與檢測原理如圖1所示：凝血酶的存在造成單鏈DNAⅠ發生構象變化，并與目標物結合形成G-四面體結構。當與DNAⅠ完全互補的單鏈DNA Ⅱ不存在時，PicoGreen染料不產生熒光信號；然而，當在該混合溶液中加入DNA Ⅱ時,DNA Ⅱ和未與凝血酶結合的DNA Ⅰ形成雙螺旋互補結構，PicoGreen染料嵌入到DNA Ⅱ-DNAⅠ雙螺旋結構中，導致熒光強度顯著增強，該熒光強度與目標物濃度成反比。

2　結果與討論

2.1凝血酶檢測條件的優化

2.1.1溶液pH值的優化在反應體系中，不同pH值的緩沖液對熒光強度的檢測具有顯著影響。實驗分別考察了pH 7.4，7.8，8.0，8.2，8.4，8.6的Tris緩沖溶液對凝血酶熒光強度檢測的影響(圖2)。結果表明pH 8.2的緩沖液稀釋效果最好。

2.1.2PicoGreen與雙螺旋DNA的反應時間反應時間對雙螺旋DNA與PicoGreen的結合能力會產生一定的影響。將雙螺旋DNA、PicoGreen與1.0×10-13mol/L凝血酶的反應體系置于不同時間下反應，檢測熒光信號變化值。結果顯示，反應15 min時熒光信號達到飽和。因此，PicoGreen和雙螺旋DNA的最佳孵化時間為15 min。

2.2靈敏度與線性范圍

在最優實驗條件下，利用適配體傳感器熒光法檢測凝血酶，發現凝血酶濃度越高，與凝血酶結合的適配體Ⅰ就越多，導致和適配體Ⅱ互補的適配體Ⅰ越少，因此熒光強度越小(圖3)。在1.0×10-14～1.0×10-7mol/L范圍內，凝血酶濃度(c，mol/L)的對數值與熒光強度變化(ΔF=Fo-F)呈線性關系(圖3插圖)，其線性方程為ΔF=240.03+17.60lgc，相關系數(r2)為0.99，凝血酶的檢出限為1.0×10-14mol/L。表1比較了不同方法對凝血酶的檢測結果，結果顯示，本文建立的傳感方法呈現了更高的靈敏度。

2.3特異性研究

考察了本方法對凝血酶檢測的特異性，將1.0×10-8mol/L牛血清蛋白(BSA)、細胞色素C(Cyt C)分別與實驗所用的核酸適配體在相同條件下反應，并檢測其相對于熒光背景的熒光信號變化(圖4)。結果顯示，相對于背景熒光強度，牛血清蛋白和細胞色素C產生了很小的熒光信號變化，而凝血酶產生了很強的熒光強度變化。考慮到生物分析體系是一個復雜的體系，當體系中存在與凝血酶適配體部分互補的適配體(5'-CCT TCC TCT GCA TCC-3’)時，則呈現出較強的熒光信號，但略低于PicoGreen嵌入完全互補的ssDNA Ⅱ-ssDNA Ⅰ所產生的熒光信號。當分別加入1.0×10-8mol/L牛血清蛋白、細胞色素C和凝血酶時，相對于加入部分互補鏈產生的背景熒光信號，加入凝血酶后產生的熒光強度明顯降低，然而牛血清蛋白和細胞色素C對背景信號幾乎無變化。表明本實驗建立的熒光傳感技術對于凝血酶分子檢測具有較高的特異性。

2.4回收率實驗

為了進一步檢驗該方法檢測實際樣品的可行性，取不含凝血酶的健康人血清，過濾后將血清樣本稀釋1 000倍，分別添加不同濃度(0.97×10-9，10.2×10-9，49.2×10-9mol/L)的凝血酶進行加標回收實驗。結果顯示，凝血酶在人血清樣品中的平均回收率為97%～102%，相對標準偏差(RSD)不大于4.8%，說明本方法可用于實際血清樣品中凝血酶的檢測。

3　結　論

本文開發了一種基于適配體的凝血酶熒光檢測方法，方法的檢測靈敏度可達1.0×10-14mol/L，線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-7mol/L。與其他檢測方法相比，該方法具有操作簡便、準確可靠、靈敏度高的特點，可用于其他適配體的目標分子檢測，并為后續熒光檢測技術的應用奠定了基礎。

[1]Stubbs M T,Bode W.Thromb.Res.,1993,69(1):1-58.

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[17]Lv Z Z,Chen A L,Liu J C,Guan Z,Zhou Y,Xu S Y,Yang S M,Li C.PlosOne,2014,9(1):e85968.

Label-free Aptamer-based Fluorescent Detection of Thrombin

GUI Li-li*

(Xinxiang Vocational and Technical College，Xinxiang453000,China)

A simple and universal aptamer-based label-free approach for highly selective and sensitive fluorescence detection of thrombin was designed.The method is based on the specific recognition ability of label-free aptamer towards their targets,and PicoGreen dye was used to transduce the fluorescent signal of the double strand DNA duplex.As an asymmetric cyanine dye,PicoGreen reagent does not produce any fluorescence signal when it extsts alone.However,upon binding to dsDNA,it shows a significant fluorescence signal whereas no significant fluorescence change could be observed when it binds to ssDNA.Based on this property,it was used in the detection of thrombin.The results showed that a dynamic range of 1.0×10-14-1.0×10-7mol/L(r2=0.99) was obtained with a detection limit as low as 1.0×10-14mol/L.In order to determine the specificity of this method,the sensing system against two interfering substances such as bovine serum albumin(BSA) and cytochrome C(Cyt C) was tested.It is found that the interfering substances(each at 1.0×10-8mol/L) could not effect on the detection of thrombin,which indicated the high selectivity of the sensing method toward thrombin.The present method was successfully applied in the determination of thrombin in real human serum with average recoveries of 97%-102%.The experiments results demonstrated that the proposed method was simple,specific and sensitive,and it was hopeful to apply in the field of medical clinical diagnosis.

aptamer;biosensor;fluorescence;thrombin

2016-01-21；

2016-02-22

貴莉莉，碩士，講師，研究方向：分析化學，Tel:0373-3720000，E-mail:40719606@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.023

O657.1；O629.8

A

1004-4957(2016)08-1054-04