固相萃取結合氣相色譜-串聯質譜測定卷煙中3種禁用香料

鄭　陽，許秀麗，紀順利，袁　飛，黃志強，楊丙成*,張　峰*

(1.華東理工大學　藥學院，上海　200237；2.中國檢驗檢疫科學研究院　煙草安全與控煙技術中心/食品安全研究所，北京　100176；3.湖南檢驗檢疫科學技術研究院，湖南　長沙　410004)

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固相萃取結合氣相色譜-串聯質譜測定卷煙中3種禁用香料

鄭陽1,2，許秀麗1，紀順利2，袁飛1，黃志強3，楊丙成1*,張峰2*

(1.華東理工大學藥學院，上海200237；2.中國檢驗檢疫科學研究院煙草安全與控煙技術中心/食品安全研究所，北京100176；3.湖南檢驗檢疫科學技術研究院，湖南長沙410004)

利用固相萃取結合氣相色譜-串聯質譜(SPE/GC-MS/MS)檢測技術，建立了煙草制品中3種禁用香料(側柏酮、樟腦及黃樟素)的高靈敏度分析方法。對前處理條件及質譜條件進行優化，在最佳實驗條件下，3種香料在10.0～500.0 μg/L質量濃度范圍內的線性關系良好(r2≥0.998 6),方法檢出限(LOD，S/N=3)及定量下限(LOQ，S/N=10)分別為2.3～5.8 μg/kg及7.7～19.3 μg/kg。在LOQ，1.5LOQ及2LOQ加標水平下，3種禁用香料的平均回收率為74.9%～90.9%，相對標準偏差(RSD)均不大于2.6%。該方法準確可靠，靈敏度高，可滿足國內對于這3種禁用香料的檢測要求。

固相萃取;氣相色譜-串聯質譜;禁用香料;卷煙

人類利用植物中的天然香味物質作為香料加入到煙草中已有很長的歷史,但植物提取物成分十分復雜,隨著對煙用香料安全性問題的日益關注和現代毒理學的發展,人們發現植物提取物尤其是精油中一些化合物可對人體造成不同性質的傷害。側柏酮[1]、樟腦[2]及黃樟素[3]廣泛存在于多種植物中，且被證實是對人體健康具有威脅的天然有害物質，其中側柏酮是艾葉揮發油的主要成分，具有神經毒性[4-6]；樟腦廣泛存在于香樟油中，對神經系統及生殖系統具有明顯毒性，可通過呼吸麻痹導致動物死亡，對生殖細胞的成熟及受精能力亦會產生影響，同時其長期慢性毒性也會對人體健康造成潛在威脅[7-9]；黃樟素是許多食用天然香精如黃樟精油、八角精油和樟腦油的主要成分，也是制備洋茉莉香精和香蘭素香精的主要原料[10-12]。黃樟素具有致癌可能性，其在小鼠體內首先代謝為苯乙醇形式，然后被激活轉化為乙酸鹽或硫酸鹽，成為最終的致癌物，后者的雙鍵因其親電性與遺傳物質DNA發生反應，可導致癌癥的發生[13-14]。基于以上原因，美國食品藥品管理局(FDA)已禁止黃樟素作為香味添加劑使用，德國煙草法、捷克煙草法也將側柏酮、樟腦及黃樟素列入不允許使用的香料物質名單。然而部分煙用添加劑如植物精油[15-16]和植物提取液在生產過程中可能帶入黃樟素、側柏酮等有害成分，因此建立簡單快速、靈敏的測定這些有害物質的分析方法對煙草制品的質量控制具有重要意義。

目前，針對這些有害物質的檢測方法報道較少[17-20]，基質主要集中于煙用精油及藥用制劑。李韻等[21]采用高效液相色譜/熒光檢測法同時測定了香精香料中的黃樟素等4種禁限用添加劑，其中黃樟素的定量下限為40 μg/kg。張琳等[22]采用離子液體-靜態頂空氣相色譜法測定了十滴水中的樟腦和桉油精，其中樟腦的檢出限為160 μg/kg。然而，煙草基質復雜，含有大量的脂肪酸、色素[23-24]等，運用現有方法已不能滿足復雜基質中的痕量檢測要求，因此發展高效、高靈敏度的檢測方法具有重要意義。本文首次利用固相萃取[25-27]結合氣相色譜-串聯質譜[28-30](SPE/GC-MS/MS)建立了針對卷煙中側柏酮、樟腦及黃樟素的檢測方法。其中，固相萃取能夠對樣品進行有效的分離、凈化及富集，而GC-MS/MS定性定量準確、抗基質干擾強、檢測靈敏度高、穩定性好。本文所建立的分析方法可為卷煙中此3種禁用香料的安全控制提供很好的技術支持。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent 7890-7000C三重四極桿氣相色譜-質譜聯用系統(GC-MS/MS)；渦旋混合儀(美國Scientific Industries公司)；KQ-500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Avanti J-26 XPI離心機(美國 Beckman Coulter公司)；超純水系統(美國Millipore Milli-Q Gradient公司)；固相萃取柱Oasis HLB，Sep-Pak C18，Sep-Pak Silica，Sep-Pak CN(規格均為6 mL/500 mg，美國Waters公司)。

正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙醇、乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；側柏酮、樟腦、黃樟素(Sigma公司)。 未經加工的烤煙葉片研磨成粉后作為空白實驗樣品。10種商品卷煙作為待測樣品。

1.2標準溶液的配制

分別稱取10 mg(精確至±0.001 mg)標準品，用正己烷溶解并定容于10 mL容量瓶中，配成1 000 mg/L的單標儲備液，將單標儲備液混合、稀釋配制成5.0 mg/L的混合工作儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存。使用前根據需要將混合工作儲備液用正己烷稀釋至所需濃度，配制系列標準溶液。

基質匹配標準溶液是按照樣品前處理步驟提取的不含目標化合物的空白基質，在空白基質上配制標準品溶液，用于制作基質匹配標準工作曲線，以對基質效應進行校正。本文采用空白樣品提取液建立基質匹配標準曲線，可從一定程度上減弱基質效應對目標物的影響。基質匹配標準溶液的配制過程為:對空白樣品(不含待測目標物的未加工烤煙煙末)按“1.3”方法進行前處理，氮氣吹至近干后分別用1.0 mL系列標準溶液復溶，過0.22 μm有機濾膜后用GC-MS/MS測定。

1.3樣品前處理

煙草樣品首先按照YC/T 31-1996[31]進行粉碎處理，即在35 ℃恒溫箱中干燥2 h除去水分，再研磨過篩，并避光保存。

精確稱取待測樣品(1.000±0.001) g，置于50 mL聚丙烯塑料離心管內，加入20 mL乙醇萃取，加蓋后輕搖離心管使溶劑浸潤煙末，放入超聲裝置中在20 ℃ 100 Hz的條件下超聲15 min，然后于4 ℃ 8 000 r/min的條件下冷凍離心10 min。吸取10 mL上清液進行SPE凈化，凈化液經氮吹、1 mL乙醇復溶后過0.22 μm有機濾膜，濾液轉移至色譜分析瓶中，用于GC-MS/MS分析測定。

1.4色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent DB-5MS 彈性石英毛細管(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL/min；不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度60 ℃，以25 ℃/min升至200 ℃；進樣量：1 μL；溶劑延遲3 min。

質譜條件：電子轟擊(EI)離子源，溫度230 ℃；電離能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；碰撞氣：氬氣；監測模式：多反應監測(MRM)模式。

2　結果與討論

2.1質譜條件的優化

采用全掃描(Full scan)方式對單個分析物標準溶液進行逐一掃描，確定待測物的母離子，然后采用產物離子掃描(Product scan)方式，對選定的母離子進行二級裂解掃描，確定產物子離子，并優化碰撞電壓，最后采用MRM模式對待測物進行定性定量分析。

碰撞電壓是MS/MS重要的參數，優化過程中，分析了不同電壓下母離子的裂解質譜圖，選出在保證母離子不被全部打碎的情況下子離子豐度最優的條件，對每一組母離子/子離子，分別選擇碰撞能量為5，10，15，20，25，30，35 V進行掃描，以響應信號大小為依據對碰撞能量進行優化;在此優化的碰撞能量附近進行微調，做二次能量優化，得到最優的碰撞能量。各目標物優化的質譜條件見表1。

表1　3種目標物的分子式、保留時間及GC-MS/MS參數Table 1　Formulas,retention times(tR) and GC-MS/MS parameters of 3 analytes

*quantitation ion pair

2.2提取溶劑的優化

提取溶劑是影響提取效率的關鍵因素，提取溶劑的極性與目標物相近，則目標物在溶劑中的溶解度較大，較易被提取，反之則很難提取完全。以100 μg/kg加標樣品回收率為指標，按照上述條件及步驟，分別考察了5種不同極性溶劑(正己烷、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇)對3種禁用香料的提取效率。結果表明，5種溶劑對目標物的提取回收率均在60%以上，其中乙醇對目標物的提取回收率最高，均大于80%。考慮到乙醇的價格較低，且毒性較小，因此實驗選用乙醇作為提取溶劑。

2.3提取時間的優化

提取時間是影響提取回收率的另一關鍵因素，提取時間過短，目標物提取不完全，提取時間過長則可能導致目標物分解，降低提取效率。實驗考察了100 μg/kg加標樣品在5，10，15，20，25 min提取時間下的提取效率，發現大部分目標物在15 min時即獲得較高的提取效率，回收率均高于80%，繼續延長提取時間，目標物回收率反而下降，這可能是由于目標物在較長時間的提取環境下發生了部分分解，導致提取效率下降。因此，確定提取時間為 15 min。

2.4固相萃取條件的優化

分析過程中發現在側柏酮的出峰時間附近有1個基質雜質峰對其干擾較大，為進一步凈化樣品，使用固相萃取柱對樣品進行凈化，并對固相萃取條件進行了考察。

2.4.1固相萃取柱的選擇考察了C18柱、HLB柱、Silica柱及CN柱4種常用的固相萃取柱。取實驗樣品加標50 μg/kg標準溶液過不同的固相萃取柱，收集上樣液和洗脫液后采用GC-MS/MS分析。首先考察了上樣階段是否穿透。樣品上樣后，收集上樣液上機檢測。結果發現，4款萃取柱均未發生穿透。隨后對比了4款萃取柱對3種目標物的回收率(圖1)。結果表明，CN柱對3種目標分析物的回收率最低；HLB柱對3種目標分析物的回收率最高，為77.5%～93.2%，因此實驗選擇HLB柱作為凈化柱。

2.4.2洗脫溶劑的選擇為了獲得最大的萃取效率，比較了丙酮、二氯甲烷、正己烷及甲醇對50 μg/kg加標樣品的洗脫效果。結果表明，正己烷對黃樟素的回收率不足40%，甲醇對側柏酮和黃樟素的回收率均低于60%，丙酮對側柏酮的回收率為58%，上述3種洗脫溶劑的回收率均無法滿足要求。當使用二氯甲烷作為洗脫溶劑時，目標物的回收率均在84%以上，故最終選擇二氯甲烷作為洗脫溶劑。

2.4.3洗脫溶劑體積的選擇考察了不同體積的二氯甲烷洗脫溶劑(1，2,3,4，5 mL)對50 μg/kg加標樣品回收率的影響。結果表明，當洗脫體積小于3 mL時，目標物的回收率隨洗脫體積的增加而增大，當洗脫體積為3 mL時，目標物的回收率均大于90%，因此選擇洗脫溶劑體積為3 mL。

實驗結果顯示，經上述優化后的固相萃取條件進行凈化后，雜質峰對側柏酮的干擾明顯降低(圖2)。

2.5線性關系、檢出限與定量下限

配制3種目標物質量濃度分別為5.0,10.0，50.0，100.0，300.0，500.0 μg/L的基質匹配標準溶液，在優化條件下，以目標組分的峰面積(Y)與對應的質量濃度(X，μg/L)繪制標準曲線，結果見表2。側柏酮、樟腦和黃樟素在10.0～500.0 μg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數均不低于0.998 6，3種化合物的檢出限(LOD，S/N=3)分別為4.3，5.8，2.3 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為14.2，19.3，7.7 μg/kg。表明方法的靈敏度可滿足痕量物質的檢測要求。

取100.0 μg/L的基質匹配標準溶液在優化條件下于同一天內連續進樣6次，其日內精密度為0.9%～2.6%;每天進樣1次，持續6 d，其日間精密度為1.1%～2.7%，說明該方法具有較好的重復性(表2)。

2.6回收率與精密度

選取空白實驗樣品，添加LOQ，1.5LOQ，2LOQ濃度水平的各物質混合標準溶液，按照本方法進行加標回收率實驗，每一濃度樣品平行測定6次，結果見表3。在不同的添加水平下，側柏酮的回收率為74.9%～80.2%，樟腦的回收率為80.1%～83.2%，黃樟素的回收率為86.8%～90.9%，3種目標物的相對標準偏差(RSD)均不大于2.6%，說明該方法的準確度及精密度較好。

表2　3種目標物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限、定量下限與精密度(n=6)Table 2　Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2),LODs,LOQs and accuracies for the determination of 3 analytes(n=6)

2.7實際樣品的測定

應用所建立的方法分別對10種實際樣品中的目標物進行測定，每個樣品重復測定6次。結果顯示，10個樣品均未檢出該3種禁用香料。

3　結　論

本文建立了一種SPE/GC-MS/MS同時測定卷煙中側柏酮、樟腦及黃樟素3種禁用香料的檢測方法。該方法靈敏度和準確度良好，可用于國內外煙草制品中側柏酮、樟腦及黃樟素的檢測分析，同時為其他基質中此3種化合物的分析提供了參考。

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Determination of Three Restricted Flavor Additives in Cigarettes by Solid-phase Extraction with Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHENG Yang1,2,XU Xiu-li1,JI Shun-li2,YUAN Fei1,HUANG Zhi-qiang3,YANG Bing-cheng1*,ZHANG Feng2*

(1.Institute of Tobacco Safety and control/Institute of Food Safety,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing100176,China;2.School of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai200237,China;3.Hunan Academy of Inspection and Quarantine,Changsha410004,China)

An analytical method for the simultaneous determination of three restricted flavor additives(3-thujanone,camphor and safrole) in tobacco products by solid-phase extraction with gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)was developed and evaluated.The extraction conditions and MS conditions were optimized.Under the optimal conditions,three flavor additives had good linearities in the range of 10.0-500.0 μg/L,with correlation coefficients(r2) not less than 0.998 6.The limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) for these additives were in the ranges of 2.3-5.8 μg/kg and 7.7-19.3 μg/kg,respectively.The average recoveries of three analysts were in the range of 74.9%-90.9% at three spiked levels of LOQ,1.5 LOQ and 2 LOQ,with relative standard deviations(RSDs) not more than 2.6%.The method is accurate,reliable and sensitive,and could satisfy the requirements for detection of three restricted flavor additives in domestic.

solid phase extraction(SPE);gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS) ;restricted flavor additives;cigarettes

2016-01-07；

2016-02-25

質檢公益性行業科研專項(201410088，201310134)；中國檢驗檢疫科學研究院基本科研業務費項目(2016JK009，2015JK008)；國家質檢總局科研計劃項目(2014IK084)；國家重大儀器設備開發專項(2012YQ14000806)

楊丙成，博士，教授，研究方向：色譜相關技術及其在藥物分析中的應用，Tel:021-64250622,E-mail:bcyang@ecust.edu.cn

張峰，博士，研究員，研究方向：食品藥品安全研究分析，Tel：010-53898008，E-mail:fengzhang@126.com

研究簡報

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.08.010

O657.6;S816.74

A

1004-4957(2016)08-0987-06