中青年高血壓病痰濕壅盛證患者尿液代謝組學(xué)分析*

吳天敏　陳金水　薛文娟△　陳玲珊

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中青年高血壓病痰濕壅盛證患者尿液代謝組學(xué)分析*

吳天敏1陳金水1薛文娟1△陳玲珊2

目的尋找中青年高血壓病痰濕壅盛證患者的尿液生物標(biāo)記群，探索其證候本質(zhì)。方法運(yùn)用1H NMR結(jié)合PLS-DA的方法對(duì)中青年高血壓病三種證型患者及健康志愿者的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，得出生物標(biāo)記物群。結(jié)果中青年高血壓病痰濕壅盛組與對(duì)照組、肝火亢盛組、陰虛陽(yáng)亢組對(duì)比，痰濕壅盛組代謝物存在顯著性變化，主要與三大代謝及嘌呤代謝關(guān)系密切。結(jié)論運(yùn)用核磁共振代謝組學(xué)方法分析尿液代謝組學(xué)，可對(duì)中青年高血壓病痰濕壅盛患者和健康者、肝火亢盛組、陰虛陽(yáng)亢組進(jìn)行區(qū)分。

高血壓病；痰濕壅盛證；代謝組學(xué)；尿液

代謝組學(xué)[1]是通過(guò)分析生物體系受到外源性或內(nèi)源性的刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化情況。本研究采用1H NMR結(jié)合PLS-DA(partial least squares-discriminate analysis，偏最小二乘法-判別分析)對(duì)中青年原發(fā)性高血壓三種常見證型及健康志愿者的尿液進(jìn)行全譜分析，確定相關(guān)生物標(biāo)志物。

1　資料與方法

1.1一般資料入選2014年9月—2015年2月就診福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓患者34例，其中，肝火亢盛組(B組)14例(41.2%)，痰濕壅盛組(C組)14例(41.2%)，陰虛陽(yáng)亢組(D組)6例(18.6%)。另選擇健康人群15人為對(duì)照組(A組)。四組性別及年齡資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)①高血壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2010年頒布的《中國(guó)高血壓防治指南》；②中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2002版《中藥新藥臨床指導(dǎo)原則》中《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導(dǎo)原則》。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)①符合高血壓病西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)主要3種證候診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～59歲人群；③屬于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)原發(fā)性高血壓，140mmHg<收縮壓<180mmHg且90mmHg<舒張壓<110mmHg；④未用藥或已服用降血壓藥物，但經(jīng)2周洗脫期后血壓達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)；⑤簽署知情同意書。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn)①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)；②各種繼發(fā)性高血壓、嚴(yán)重心腦肝腎肺疾患者；③急慢性感染性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良患者；④合并有精神病者及孕婦、哺乳期婦女。

1.5材料與方法

1.5.1試劑和儀器3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉鹽(TSP)(SIGMA)、重水(D20)(MREDA)、核磁共振波譜儀(AVANCE III 500MHz)(BRUKER)。

1.5.2尿液樣品預(yù)處理精密移取中段尿300μl，加入緩沖液(PH7.4)200μl、含TSP的重水(TSP/D2O=1mg/1ml)100μl，混勻5min，4℃，12000r/min，離心5min，取上清液500ul，置于5mm核磁管中，送至福州大學(xué)測(cè)試中心使用AVANCE III 500MHz型核磁共振波譜儀進(jìn)行核磁共振圖譜檢測(cè)。

1.5.3觀察指標(biāo)尿液代謝組。

1.5.4數(shù)據(jù)采集和處理在超導(dǎo)傅立葉變NMR譜儀上調(diào)用noesygppr1d脈沖序列, 去除尿液中大分子干擾。相關(guān)參數(shù)：譜寬 6009.615Hz，采樣時(shí)間 2.0480s，將1H NMR FID(free induction decay, 自由感應(yīng)衰減)信號(hào)導(dǎo)入 Chenomx NMR suit(version 8.0, Chenomx, Edmonton, Canada)軟件，自動(dòng)進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換，調(diào)整相位，校正基線，尿液以峰 TSP(0.0ppm)作為全部譜圖化學(xué)位移的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)0.1～10.0 ppm 范圍內(nèi)的譜峰進(jìn)行分析，以0.04 ppm 單位的化學(xué)位移為分段積分單元。為防止水的殘留峰干擾，尿液樣本除去4.65～4.90ppm(水峰)處的分段積分。再將所有積分值的面積進(jìn)行歸一化處理，導(dǎo)到execl表格中，得到每個(gè)分段和對(duì)應(yīng)的積分面積值的矩陣。最后把變量矩陣做為源數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的PLS-DA。

1.5.5數(shù)據(jù)分析將存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)文件經(jīng)PLS-DA得到得分圖和載荷圖，據(jù)相應(yīng)的載荷圖尋找不同證型較大的變量(化學(xué)位移)，確定兩組之間的共性代謝物和差異生物標(biāo)記物。將有差異的代謝物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，得出每種代謝物涉及的代謝途徑。

2　結(jié)果

2.1痰濕壅盛組與對(duì)照組分析比較

2.1.1PLS-DA分析痰濕壅盛組與對(duì)照組PLS-DA

得分圖如圖1，兩組之間存在較顯著差異。載荷圖如圖2顯示兩組之間的差異化學(xué)位移點(diǎn)，其離中心點(diǎn)越遠(yuǎn)，則對(duì)區(qū)分樣本所做的貢獻(xiàn)越大。根據(jù)差異化學(xué)位移點(diǎn)得出其所代表的化合物，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，得出兩組有顯著差異的化合物(P<0.05)。

圖1　C組與A組得分圖

圖2　C組與A組載荷圖

2.1.2代謝物成分分析表2得出高血壓病痰濕壅盛組與對(duì)照組之間有顯著差異的化合物：尿素、檸檬酸鹽、乙醇胺、π-甲基組氨酸、谷氨酰胺、肌酸。將上述6種化合物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，說(shuō)明主要涉及氨基酸代謝、糖代謝、脂代謝、核酸代謝。

表2　C組與A組之間有顯著性差異的化合物涉及到的代謝途徑

2.2痰濕壅盛組與肝火亢盛組分析比較

2.2.1PLS-DA分析通過(guò)痰濕壅盛組與肝火亢盛組得分圖如圖3，發(fā)現(xiàn)兩組之間存在顯著差異。載荷圖如圖4顯示的是兩組之間的差異化學(xué)位移點(diǎn)，得出其所代表的化合物，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)得出兩組有顯著差異的化合物(P<0.05)，見表3。

圖3　C組與B組得分圖

圖4　C組與B組載荷圖

KEGG編號(hào)化合物代謝途徑功能分類變化趨勢(shì)K01427尿素嘌呤代謝精氨酸和脯氨酸代謝核酸代謝氨基酸代謝↑K01470肌酐精氨酸和脯氨酸代謝氨基酸代謝↓K00894乙醇胺甘油磷脂代謝脂代謝↓K00933肌酸精氨酸和脯氨酸代謝氨基酸代謝↓K01451馬尿酸苯丙氨酸代謝氨基酸代謝↓K00270苯丙氨酸酪氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸代謝氨基酸代謝↓

2.2.2代謝物成分分析表3得出高血壓病痰濕壅盛組與肝火亢盛組間存在差異的化合物有：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、馬尿酸、苯丙氨酸。將上述6種化合物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，說(shuō)明兩組主要涉及到的代謝途徑包括氨基酸代謝、脂代謝、核酸代謝等。

2.3痰濕壅盛組與陰虛陽(yáng)亢組分析比較

2.3.1PLS-DA分析痰濕壅盛組與陰虛陽(yáng)亢組得分圖如圖5，發(fā)現(xiàn)兩組間存在顯著的差異。載荷圖如圖6顯示兩組之間的差異化學(xué)位移點(diǎn)，得出所代表的化合物，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)得出兩組有顯著差異的化合物(P<0.05)，見表4。

圖5　C組與D組得分圖

圖6　C組與D組載荷圖

2.3.2代謝物成分分析表4得出高血壓病痰濕壅盛組與肝火亢盛組間存在差異的化合物有：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲基、谷氨酰胺、肌酸。將上述6種化合物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)其主要與三大代謝、核酸代謝有關(guān)。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)用1H NMR來(lái)檢測(cè)痰濕壅盛組、陰虛陽(yáng)亢組、肝火亢盛組及對(duì)照組尿液代謝物，初步建立中青年高血壓病痰濕壅盛證的生物標(biāo)志物群：尿素、檸檬酸鹽、乙醇胺、谷氨酰胺、π-甲基組氨酸、肌酸。痰濕壅盛證與肝火亢盛證有顯著性差異的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、馬尿酸、苯丙氨酸。痰濕壅盛證與陰虛陽(yáng)亢證有顯著性差異的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲胺、谷氨酰胺、肌酸。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的查閱，得出其主要與氨基酸、糖類、脂類三大代謝及嘌呤代謝等途徑有關(guān)。

表4　C組與D組之間有顯著性差異的化合物涉及到的代謝途徑

尿素的代謝途徑包括氨基酸代謝及嘌呤代謝。痰濕壅盛組與其余三組對(duì)比尿素顯著增高，說(shuō)明痰濕壅盛證患者氨基酸和(或)嘌呤代謝必然有一環(huán)節(jié)存在異常[2]，可能與當(dāng)代中青年大多喜飲酒、吃肉等高嘌呤、高蛋白食物有關(guān)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)嘌呤或氨基酸代謝異常時(shí)可引起尿素堆積，而過(guò)食肥甘厚膩易致機(jī)體內(nèi)生痰濕，故痰濕壅盛證患者尿素顯著高于其他三組。

檸檬酸鹽是檸檬酸與水中碳酸鹽作用生成。其主要涉及到三羧酸循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，這兩個(gè)循環(huán)中存在著某些相同的酶類和中間產(chǎn)物，其中乙酰CoA占重要位置，而乙酰CoA是經(jīng)過(guò)脂肪酸氧化分解的產(chǎn)物，故脂肪酸代謝異常可能是血壓升高的一個(gè)重要點(diǎn)[3]。與健康人相比，中青年高血壓痰濕壅盛證尿液中檸檬酸鹽含量相對(duì)較低，與體內(nèi)乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)中間的環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙、機(jī)體內(nèi)能量代謝紊亂有關(guān)，當(dāng)大量脂肪酸氧化分解時(shí)，可能導(dǎo)致體內(nèi)酸性物質(zhì)沉積，體內(nèi)酸中毒可導(dǎo)致檸檬酸鹽的重吸收增加，使尿中的檸檬酸鹽排出減少；酸性物質(zhì)沉積還可抑制氧化酶類的活性，導(dǎo)致中間產(chǎn)物檸檬酸等在體內(nèi)堆積，使其在尿液中的水平降低。

乙醇胺與甘油磷脂代謝相關(guān)，其可與磷脂酸合成磷脂酰乙醇胺，在肝臟中轉(zhuǎn)變?yōu)榱字Ｄ憠A。在血液中，膽固醇和脂肪酸可被磷脂酰膽堿化為極細(xì)的顆粒從血管中排出，使血流通暢，故磷脂酰膽堿被譽(yù)為“血管清道夫”[4]；乙醇胺還為合成擴(kuò)張血管和降壓藥物的原料，故推測(cè)若機(jī)體內(nèi)乙醇胺降低可間接導(dǎo)致血液中的膽固醇和脂肪酸沉積，血管阻力增高，最終引起血壓升高。這可能是高血壓病痰濕壅盛證乙醇胺低于對(duì)照組的原因。痰濕壅盛證組乙醇胺較肝火亢盛組及陰虛陽(yáng)亢[5]組顯著降低，說(shuō)明痰濕壅盛證患者普遍存在脂類代謝顯著異常，可以推測(cè)“痰濁”之邪對(duì)脂類代謝影響大。

谷氨酰胺、肌酸、肌酐、馬尿酸、苯丙氨酸等涉及到氨基酸代謝。痰濕壅盛證患者常常高脂高糖飲食，這會(huì)引起氨基酸代謝異常。正常情況下人體尿液中含有少量的馬尿酸，馬尿酸為消化道微生物的腐敗產(chǎn)物[6]。苯丙氨酸屬于必需氨基酸，需要通過(guò)食物補(bǔ)充，否則人體機(jī)能就不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)。故可以推測(cè)痰濕壅盛證組谷氨酰胺、肌酸、肌酐、馬尿酸、苯丙氨酸等異常可能與飲食有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。

通過(guò)中青年高血壓病痰濕壅盛證與肝火亢盛證、陰虛陽(yáng)亢證對(duì)比得出顯著性差異的代謝物的代謝途徑以三大代謝及嘌呤代謝途徑為主，為中青年高血壓病痰濕壅盛證的標(biāo)準(zhǔn)化研究提供思路，未來(lái)可進(jìn)一步朝這個(gè)方向深入研究，確立高血壓病痰濕壅盛證的客觀化動(dòng)態(tài)診斷指標(biāo)，用以指導(dǎo)臨床。

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Analysis on Metabolomics of Urine Samples in Young and Middle-aged Patients with Hypertension of Phlegm Dampness Retention Syndrome

WU Tianmin1CHEN Jinshui1XUE Wenjuan1CHEN Lingshan2

(1.Department of Traditional Chinese Medicine, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350005, China；2.Grade 2012 Graduate of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350005, China)

ObjectiveTo analyze the urine samples of young and middle-aged patients with hypertension of phlegm dampness retention syndrome by means of metabonomics, and to confirm its biomarker. MethodThrough the 1HNMR technique combined with partial least squares-discriminate analysis (PLS-DA) method, the biomarkers were selected. ResultThe compounds had significant differences between young and middle-aged patients with hypertension of phlegm dampness retention group and the control group. ConclusionMetabonomics might provide a clear physical basis for distinguishing young and middle-aged patients with hypertension of phlegm dampness retention syndrome and liver-fire hyperactivity syndrome, yin deficiency and yang hyperactivity syndrome, healthy people.

Hypertension; Phlegm dampness retention syndrome; Metabonomics; Urine

福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目基金(No.wzln201303)

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科(福州 350005)；2.福建醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床碩士研究生2012級(jí)(福州 350005)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.17.004

1003-8914(2016)-17-2458-04

(本文校對(duì)：范柳芳2015-10-18)