大黃蒽醌類化合物柱色譜分離的教學實驗項目設計※

侯劍偉　張彤　丁越　劉云　劉祥蘭

（上海中醫藥大學教學實驗中心，上海201203）

大黃蒽醌類化合物柱色譜分離的教學實驗項目設計※

侯劍偉張彤丁越劉云劉祥蘭

（上海中醫藥大學教學實驗中心，上海201203）

目的色譜分析實驗中柱色譜分離實驗是中藥學專業學生需掌握的一個實驗技能，學生通過該實驗掌握實驗技能外，還通過該實驗掌握色譜中一些常用術語和參數的計算及意義。方法用硅膠柱色譜分離大黃蒽醌類化合物，以硅膠（200～300目）為吸附劑、石油醚：乙酸乙酯（4∶1）為洗脫劑洗脫。結果蒽醌類化合物在洗脫過程中，中能明顯分離3個色帶，色帶間分離度良好。結論以柱色譜分離大黃蒽醌類化合物做為色譜分析中柱層析實驗，完全滿足實驗教學需要。

色譜；大黃；蒽醌類化合物；柱層析；實驗教學

色譜分析實驗是中藥學專業必須掌握的一類實驗，其內容主要包括柱層析、薄層色譜層析及色譜類儀器分析實驗。學生通過該類實驗課程，不僅學習實驗的操作技能，更通過該類課程加深儀器分析課程中色譜理論的學習。大黃蒽醌類化合物提取分離實驗項目在部分中醫藥院校有開設，但主要開設在中藥化學、天然藥物化學課程中。中化類課程側重利用PH萃取法分離鑒定大黃中游離蒽醌，而大黃分離應用在色譜分析類實驗中較少。大黃根莖中主要含有五種蒽醌類化合物，極性由大到小為大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。由于結構不同，極性不同，在硅膠柱色譜上的吸附性能也不同，可用硅膠柱色譜法分離。

1　儀器與試劑

石油醚60℃～90℃（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），乙酸乙酯（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），柱層析用硅膠200～300目（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；硅膠H板（青島海洋化工有限公司）。樣品制備：大黃乙醇提取物：取大黃粉末100 g，加入400 ml乙醇，超聲提取30分鐘，過濾藥材殘渣，減壓回收乙醇，得到大黃乙醇提取物。大黃乙醇提取物拌硅膠樣品：取大黃乙醇提取物，加入3倍量的柱層析用硅膠，加入乙酸乙酯適量復溶，連同硅膠在旋轉蒸發儀上蒸干待用。

2　實驗步驟

2.1大黃蒽醌化合物的柱色譜分離裝柱：取柱內徑為1.5 cm的色譜柱一根，長度約30 cm，按柱層析干法裝柱，將7 g柱層析硅膠裝入色譜柱中，輕輕敲打色譜柱，使之結實備用。上樣：將0.2 g左右的苷元硅膠混合物加于硅膠上端，平鋪成一薄層，再在上面加入1 cm的石英砂。洗脫：取石油醚：乙酸乙酯（4∶1）的混合溶劑洗脫。大黃蒽醌類化合物在層析柱中顯3個色帶，由下至上，第一色帶為大黃素甲醚與大黃酚的混合物、第二色帶為大黃素，第三色帶為蘆薈大黃素。用量筒收集各色帶及空白帶，方便記錄其體積。

2.2數據記錄記錄所用硅膠用量（m），初次加入硅膠柱上端洗脫劑的體積（約30 ml）及在色譜柱中高度H0，打開活塞，第一滴洗脫液流出色譜柱時，殘留石英砂上端洗脫液高度（H1），色譜柱內徑（d），計算死體積（V0），記錄洗脫各個色帶或空白帶的保留體積。用尺量出各色帶流出色譜柱時的高度（WR）。記錄參數見圖1。

圖1　大黃蒽醌柱色譜分離示意圖

2.3計算和分析本實驗學生需掌握柱色譜分離的實驗操作步驟，還需結合實驗對色譜參數進行計算，計算參數如下：死體積V0：指的是色譜柱中未被固定相占據的空隙體積，對于本實驗，即第一次加入色譜柱的流動相體積減去當第一滴洗脫液流出色譜柱時柱上端的洗脫劑體積。數據記錄時記錄第一次加入洗脫劑時柱上端洗脫劑高度H0，加入的體積V初（約30ml），當第一次洗脫劑流出色譜柱時，色譜柱上端殘留洗脫劑高度H1。死體積V0計算公式可簡化為：

保留體積VR：從洗脫開始到某組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。本實驗有3個色帶，其保留體積VR計算公式為：

調整保留體積VR：扣除死體積后的保留體積。其計算公式為：

理論塔板數nR：色譜柱分離效率的指標。其計算公式為：

分配系數K：溶質在兩相中的遷移能力及分離效能

2.4大黃蒽醌化合物薄層色譜鑒定取大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素標準品，甲醇分別配制成0.5 mg/ml溶液。吸取上述三種對照溶液及收集到的3個色帶分別點于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（30～60℃）一甲酸乙酯一甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［1］。

4　大黃苷元提取物制備考察

大黃苷元提取一般所用方法為甲醇加熱回流，或三氯甲烷回流提?。?-3］。所用試劑量大，步驟繁瑣，本文采用乙醇超聲提取的方法，并對這三種提取方法進行了提取率、耗時、實驗結果進行了考察，結果見表1。

表1　不同提取方法對實驗結果的影響

由表1可見雖然甲醇回流與氯仿回流提取率較高，但兩者耗時較長，步驟繁瑣，試劑用量較大，有一定的毒性，而乙醇超聲耗時短，試劑用量小，無毒。對實驗結果無影響。實際每組學生用量約0.06 g提取物浸膏粉，用量較少。因此選用乙醇超聲提取大黃苷元混合物，大大簡化實驗準備工作量。

5　洗脫劑體系的考察

原大黃蒽醌柱色譜分離實驗洗脫劑體系為三氯甲烷：丙酮（95∶5），三氯甲烷對心、肝、腎有損害，為可疑致癌物［4］，在倡導綠色化學的今天，少用及不用對環境、人體危害大的試劑已成了共識，因此考察了幾個洗脫劑體系替代掉三氯甲烷，以分離色帶、分離度、實驗耗時作為考察指標，考察結果見表2

表2　不同洗脫劑對實驗結果的考察

由表2可見，各色帶間的分離度都能達到＞1.5，能夠完全分離。用三氯甲烷：丙酮和二氯甲烷：丙酮體系只能分離2個色帶，環已烷：乙酸乙酯體系耗時太長，不適合作為教學實驗，因此選用石油醚：乙酸乙酯體系。

6　洗脫劑比例及硅膠用量的考察

對不同比例石油醚：乙酸乙酯洗脫劑及硅膠用量進行優化，以分離度與實驗耗時作為考察指標結果如下

表3　洗脫劑比例及硅膠用量的考察

從表3的結果來看，硅膠用量降至7 g后，實驗耗時能滿足實驗教學需要，色帶間均能完全分離。根據實際教學時間安排，選用石油醚：乙酸乙酯4∶1硅膠用量為7 g的條件對大黃蒽醌提取物進行分離。

7　結語

選用大黃作為作為通過柱層析實驗學習色譜理論的實驗教學其優點：大黃蒽醌類化合物其顏色黃色，在該實驗中，能明顯的在色譜柱中顯示3個色帶，學生可憑肉眼觀察，進行數據的記錄并進行相關色譜參數的計算。該實驗所用試劑安全低毒，用量少，分離產物可用作下一步實驗的材料，實驗契合綠色化學5R的理念。該課程可靈活銜接其他實驗項目，方便開設綜合類實驗項目。分離的產物可用過薄層層析、高效液相色譜進行純度的鑒定等。該實驗實驗時間適中，從教師講解到學生完成實驗需時150～180 min，滿足本?？茖W校一次實驗課的時間。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.2015:22.

［2］張海暉，裘愛泳，等.超聲技術提取大黃蒽醌類成分［J］.中成藥，2005，27 （9）:1075.

［3］劉建華，韓立強，等.提取方法對大黃蒽醌類成分及抗氧化活性的影響［J］.安徽農業科學，2008，36（22）:9484.

［4］曹勵，陳瑛，等.氯仿對機體免疫功能的毒性作用［J］.西安交通大學學報：醫學版，2003（4）.

A Teaching Experiment Project Design of Rhubarb Anthraquinones Compounds Column Chromatography Separation

HOU Jianwei，ZHANG Tong，DING Yue，LIU Yun，LIU Xianglan
（Experimental Center for Teacher&Learning，Shanghai University of TCM，Shanghai 201203，China）

Objective The column chromatography separation in chromatographic analysis experiment is one of majors of Chinese materia medica students to master the experimental skills.Through the experiment，students grasp the skill of experiment，and through the experiment，students master some common terms in chromatography and parameter calculation and significance.Methods Using silica gel column chromatography separation of rhubarb anthraquinone compounds，silica gel（200-300 mesh）was used as adsorbent，petroleum ether，ethyl acetate（4：1）was used as the eluent elution.Results The anthraquinone compounds in the process of elution can clearly separate 3 ribbons，and ribbon between the separation degree is good.Conclusion By column chromatography separation of rhubarb anthraquinone compounds as a chromatographic column chromatography in the analysis of the experiment fully meets the needs of the experiment teaching.

chromatography；rhubarb；anthraquinones compounds；column chromatography；experimental teaching

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.18.059

1672-2779（2016）-18-0133-02

（本文編輯：李海燕本文校對：丁越2016-07-11）

上海中醫藥大學教學課程建設項目資金支持（No：SHUTCM2015ZDKCJS006，SHUTCM2015KCJS043）