微量肉湯稀釋法檢測金黃色葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥結果分析

江培濤,楊　健,楊正南,朱　俊

(南京鼓樓醫院集團儀征醫院檢驗科，江蘇儀征 211900)

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·臨床研究·

微量肉湯稀釋法檢測金黃色葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥結果分析

江培濤,楊健,楊正南,朱俊

(南京鼓樓醫院集團儀征醫院檢驗科，江蘇儀征 211900)

目的檢測金黃色葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥的情況，指導臨床合理用藥。方法用微量肉湯稀釋法檢測175株金黃色葡萄球菌對紅霉素、克林霉素及誘導型克林霉素耐藥的情況。結果175株金黃色葡萄球菌中，紅霉素和克林霉素均敏感的有29株；紅霉素和克林霉素均耐藥的有38株；紅霉素敏感而克林霉素中介的有2株；紅霉素敏感而克林霉素耐藥的有0株；紅霉素耐藥而克林霉素中介的有18株；紅霉素耐藥而克林霉素敏感的有72株；誘導型克林霉素耐藥試驗陽性的有55株。結論誘導型克林霉素耐藥的發生率較高，臨床微生物室在發現紅霉素耐藥而克林霉素非耐藥的金黃色葡萄球菌時，必須檢測其誘導型耐藥性，指導臨床合理使用抗菌藥。

微量肉湯稀釋法；金黃色葡萄球菌；誘導型克林霉素耐藥

金黃色葡萄球菌是臨床常見的病原性葡萄球菌，主要引起局部化膿性感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染性疾病。以紅霉素和克林霉素為代表的大環內酯類和林可霉素類抗菌藥物是臨床用于治療金黃色葡萄球菌感染的重要藥物。克林霉素耐藥具有結構型和誘導型兩種耐藥表型，紅霉素耐藥具有誘導克林霉素耐藥的作用[1-2]。美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2004年將D試驗列入葡萄球菌屬克林霉素誘導型耐藥的檢測。D試驗雖操作簡單，但為紙片法，這給采用微量肉湯稀釋法檢測細菌耐藥性的實驗室帶來了一些問題。目前已有國內外學者對微量肉湯稀釋法檢測誘導型克林霉素耐藥進行了詳細的研究[3-6]，證實稀釋法與D試驗具有很好的一致性。本研究采用肉湯稀釋法檢測金黃色葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥的情況，現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1菌株來源收集2014年1月至2015年12月本院門診及住院患者標本中分離的金黃色葡萄球菌175株，剔除同一患者同種標本重復分離株。所有菌株均經血漿凝固酶試驗和細菌鑒定分析儀確認。質控菌株為ATCC29213，購自江蘇省臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑Microscan-AS4細菌鑒定藥敏分析儀為德國西門子公司產品，CAMHB肉湯、PC33型葡萄球菌鑒定藥敏復合板均為西門子公司配套產品。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗微量肉湯稀釋法檢測紅霉素、克林霉素的耐藥性。所有操作和判斷標準按照《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)和2012版CLSI標準執行[7-8]。紅霉素敏感的判斷折點為≤0.5 μg/mL,中介折點為1～4 μg/mL,耐藥折點為≥8 μg/mL；克林霉素敏感的判斷折點為≤0.5 μg/mL,中介折點為1～2 μg/mL,耐藥折點為≥4 μg/mL。

1.3.2克林霉素誘導耐藥試驗在復合藥敏孔中含有4 μg/mL紅霉素和0.5 μg/mL克林霉素，并將菌液濃度配制為5×105CFU/mL,置35 ℃恒溫培養箱孵育18～24 h。以復合藥敏孔中有細菌生長為誘導型耐藥試驗陽性，否則為陰性。

1.4耐藥表型判斷紅霉素和克林霉素均耐藥為結構型耐藥；紅霉素耐藥而克林霉素敏感且誘導試驗陽性為誘導型耐藥。

1.5統計學處理采用SPSS19.0統計軟件對數據進行處理和分析，計量資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1金黃色葡萄球菌對紅霉素、克林霉素的耐藥表型175株金黃色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)88株，占50.3%，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)87株，占49.7%。結構型耐藥的發生率為21.7%(38株)。誘導型克林霉素耐藥試驗陽性2014年有21株(6株MRSA，15株MSSA)，2015年有34株(19株MRSA，15株MSSA)，發生率為31.4%。見表1。

表1　　金黃色葡萄球菌對紅霉素、克林霉素的耐藥表型(n)

注：EM為紅霉素；CM為克林霉素；S為敏感；I為中介；R為耐藥。

2.2誘導型克林霉素耐藥發生率比較88株MRSA中，結構型耐藥的發生率為33.0%(29株)，誘導型耐藥的發生率為28.4%(25株)；87株MSSA中，結構型耐藥的發生率為10.3%(9株)，誘導型克林霉素耐藥的發生率為34.5%(30株)。兩者誘導型克林霉素耐藥試驗陽性率比較的，差異無統計學意義(χ2=0.749，P>0.05)。

3　討　　論

紅霉素主要用于治療包括金黃色葡萄球菌在內的革蘭陽性球菌引起的各種感染，臨床常用作對青霉素過敏者的替代藥物。克林霉素主要用于革蘭陽性球菌及厭氧菌引起的呼吸道、軟組織、膽道、腹腔及婦科等感染，是金黃色葡萄球菌骨髓炎的首選治療藥物[9]。然而，隨著近年來MRSA檢出率的逐年增高[10-11]，葡萄球菌對大環內酯類抗菌藥物也呈現出不同程度的耐藥，其耐藥機制主要表現為藥物泵出和核糖體藥物結合靶位的改變。泵出型耐藥由msrA基因編碼，表型為紅霉素耐藥而克林霉素敏感，且誘導實驗陰性；核糖體藥物結合靶位改變是由erm基因調控的，分為自身結構的變異和紅霉素誘導產生的變異[12]，其中前者的耐藥表型為紅霉素和克林霉素同時耐藥，又稱為結構型耐藥，后者的耐藥表型為紅霉素耐藥克林霉素敏感，經紅霉素誘導后克林霉素耐藥[13]。這種菌株體外藥敏試驗克林霉素表現為敏感，但實際使用中治療無效。

上述三種耐藥表型中，結構型耐藥易于檢測，臨床微生物實驗室需要區分泵出型和誘導型耐藥，即對紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的情況進行克林霉素誘導型耐藥檢測并報告給臨床相應的結果。目前CLSI推薦的檢測方法有D試驗和微量肉湯稀釋法，前者簡單直觀，適用于手工檢測，后者易于與微生物鑒定板條整合并一體化，適用于儀器檢測。有研究表明這兩種方法檢測誘導型克林霉素耐藥試驗具有很好的一致性[3-6]。本研究用微量肉湯稀釋法檢測金黃色葡萄球菌的誘導型克林霉素耐藥試驗，結果顯示在175株金黃色葡萄球菌中，結構型耐藥的發生率為21.7%(38株)，誘導型克林霉素耐藥的發生率為31.4%(55株)，比國內關幼華等[14]報道略低。MRSA的檢出率為50.3%(88株)。在88株MRSA中，結構型耐藥的發生率為33.0%(29株)，誘導型克林霉素耐藥的發生率為28.4%(25株)；在87株MSSA中，結構型耐藥的發生率為10.3%(9株)，誘導型克林霉素耐藥的發生率為34.5%(30株)，低于國內徐洪偉等[15]的報道。造成這些差異的原因可能與因地區差異的耐藥基因不同，以及與該類抗菌藥物在不同地區的使用頻度甚至各個實驗室細菌鑒定和藥敏試驗的操作水準有關，還有待進一步探索。

本研究顯示，金黃色葡萄球菌的誘導型克林霉素耐藥發生率很高，微生物實驗室在給臨床報告紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的藥敏試驗結果時，還應該報告誘導型克林霉素耐藥試驗的結果，以免林可霉素類抗菌藥物被濫用，造成患者的經濟損失和耐藥菌株的流行。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.047

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1673-4130(2016)17-2467-03

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