丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測方法確認

曾付芳,吳　丹,周　吉,田　方,彭冬菊

(湖北省十堰市中心血站　442000)

?

·論著·

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測方法確認

曾付芳,吳丹,周吉,田方,彭冬菊

(湖北省十堰市中心血站442000)

目的對獻血者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)采用速率法進行檢測，并對這種方法進行性能驗證，證明其滿足ISO15189的要求。方法按照CNSA-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則》及《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2012版)的要求對檢測系統(tǒng)的精密度、正確度、靈敏度、可報告范圍、生物學(xué)參考區(qū)間以及測量不確定度進行驗證。結(jié)果ALT質(zhì)控血清和兩個濃度獻血者標(biāo)本檢測20次和20 d的批內(nèi)不精密度<5.0%，批間不精密度<6.7%；正確度估計通過2014年的原衛(wèi)生部室間質(zhì)評結(jié)果分析和校準(zhǔn)品結(jié)果分析，相對偏倚均小于1/2CLIA′88允許總誤差；可報告范圍用直線回歸得到回歸方程Y=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4)，該檢測范圍內(nèi)結(jié)果準(zhǔn)確；生物學(xué)參考區(qū)間為0.0～32.7 U/L；測量不確定度為(74.90±3.32)U/L。結(jié)論ALT檢測方法的性能指標(biāo)均符合ISO15189的預(yù)期要求，該方法可以作為實驗室的血液篩查檢測方法。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；確認；性能驗證

為進一步提高血站血液篩查實驗室的檢測能力，保證血液檢測質(zhì)量，本站于2014年末申請ISO15189質(zhì)量體系認證。ISO15189要求實驗室使用的檢測方法是經(jīng)過確認的檢測方法。本站在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測方法確認中，依照ISO15189的要求[1-2]，結(jié)合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]，對定量試驗的性能指標(biāo)，包括精密度、正確度、靈敏度、可報告范圍、生物學(xué)參考區(qū)間以及被測量值的測量不確定度6個方面進行驗證。現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源

1.1.1精密度采用試劑廠家配套質(zhì)控品。北京中生質(zhì)控品(批號141052，65.3 U/L)，兩個近期已檢測的獻血者標(biāo)本(檢測值為20～50 U/L)。由于當(dāng)時只有一種濃度的質(zhì)控品，血站ALT臨界值設(shè)定為50 U/L，而臨界值附近的標(biāo)本精密度直接影響血液報廢率，故選擇用臨界值附近的獻血者標(biāo)本代替。

1.1.2正確度采用原衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評的標(biāo)本(編號1451～1455)，英國朗道校準(zhǔn)品(批號910UN)。

1.1.3靈敏度采用湖北省臨檢中心PT能力驗證標(biāo)本(編號201513， 96.9 U/L)。

1.1.4可報告范圍(1)采用參加原衛(wèi)生部室間質(zhì)評活動成績合格的實驗室標(biāo)本，高濃度標(biāo)本(761 U/L)，低濃度標(biāo)本(20 U/L)；(2)蒸餾水作為標(biāo)本。

1.1.5生物學(xué)參考區(qū)間采用ALT初篩檢測(干化學(xué)法)、復(fù)檢(速率法)檢測合格的獻血者標(biāo)本160份。

1.1.6測量不確定度采用試劑廠家配套校準(zhǔn)品。北京中生生化多項校準(zhǔn)品(批號150085))，北京中生ALT非定值質(zhì)控品(74.9 U/L)。

1.2儀器與試劑儀器為美國貝克曼公司AU400全自動生化分析儀，試劑為北京中生公司產(chǎn)品(批號140571)。

1.3方法

1.3.2正確度估計通過對2014年參加原衛(wèi)生部室間質(zhì)評結(jié)果進行比較，對英國朗道校準(zhǔn)品的結(jié)果進行比較，分別計算相對偏倚，相對偏倚小于1/2CLIA′88允許總誤差10%為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3靈敏度驗證將湖北省臨檢中心PT能力驗證標(biāo)本稀釋為90 U/L進行檢測，驗證吸光度變化率是否在廠家濃度為90 U/L的吸光度變化率范圍內(nèi)。

1.3.6測量不確定度以標(biāo)準(zhǔn)差的形式可提供不確定度的估計值(稱為標(biāo)準(zhǔn)不確定度)，通過單個分量方差相加合成測量過程多個分量的估計值，然后取方差合成的平方根Uc(稱為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度)。這些分量的方差可通過試驗方式(稱為A類不確定度)或理論方式(稱為B類不確定度)進行估計。最后，不確定度可表達為具有規(guī)定包含因子的置信區(qū)間(95%區(qū)間具有包含因子為2的U，即擴展不確定度或擴展合成不確定度[4])。參照文獻[5]的方法，每天檢測1次質(zhì)控品，連續(xù)檢測10 d，計算日間標(biāo)準(zhǔn)差，不確定度分量的定量Uc=U2(rep)+U2(δ)，U(rep)為重復(fù)測量的不確定度分量，U(δ)為儀器和試劑帶來的不確定度分量。U(rep)=0.865 U/L(重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度)；U(δ1)=0.82 U/L(儀器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度)；U(δ2)=1.15 U/L(校準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)不確定度)。

2　結(jié)　　果

2.1精密度估計3個濃度的定值血清的批內(nèi)和批間精密度見表1，批內(nèi)精密度分別為1.446%、2.101%、2.833%，符合批內(nèi)不精密度<5.0%的要求；批間精密度分別為2.360%、1.970%、3.640%，符合批間不精密度<6.7%的要求。

表1　　精密度檢測結(jié)果

2.2正確度估計2014年參加原衛(wèi)生部室間質(zhì)評結(jié)果(偏倚分別為-3.03%、-3.03%、-2.82%、-1.74%、-1.41%)和英國朗道校準(zhǔn)品結(jié)果相對偏倚比較，原衛(wèi)生部PT結(jié)果偏倚最大值為-3.03%，英國朗道校準(zhǔn)品偏倚為-1.56%，均小于1/2CLIA′88允許總誤差10%的要求。

2.3靈敏度驗證將湖北省臨檢中心PT能力驗證標(biāo)本稀釋為90 U/L進行檢測，吸光度變化率為0.020 A/min，在廠家要求的吸光度變化率范圍內(nèi)(0.010～0.080 A/min)。

2.4可報告范圍6個濃度的線性物質(zhì)標(biāo)本預(yù)期值X，實測值Y，用直線回歸做數(shù)據(jù)處理，得到回歸方程Y=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4)，截距a和斜率b通過t檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為-1.41、-0.42，P>0.05)。蒸餾水檢測20次結(jié)果的可報告范圍為1.17～757.70 U/L,在廠家檢測蒸餾水的線性范圍內(nèi)(10.0～800.0 U/L)。見表2。

表2　　可報告范圍檢測結(jié)果(U/L)

2.5生物學(xué)參考區(qū)間160份獻血者標(biāo)本檢測結(jié)果的生物學(xué)參考區(qū)間為0.0～32.7 U/L。

2.6測量不確定度根據(jù)Uc的相關(guān)公式，計算得到Uc為1.66 U/L，擴展不確定度U為3.32 U/L(k=2)，測量不確定度報告為(74.90±3.32)U/L。

3　討　　論

檢測方法的確認是證實一種在實驗室使用的方法(檢驗標(biāo)準(zhǔn))的適用性的過程。對檢測方法的確認要盡可能全面，并通過客觀證據(jù)(以性能特征形式)證實滿足檢測預(yù)期用途的特定要求[1]。方法確認是保證實驗室結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。對性能指標(biāo)進行驗證，可以獲得該方法能夠得到準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測結(jié)果的證據(jù)。

精密度的驗證最常用的方法是采用穩(wěn)定的標(biāo)本做重復(fù)檢測，計算批內(nèi)精密度和批間精密度。精密度的好壞通常采用不精密度表示，不精密度通常以CV體現(xiàn)。本室檢測批內(nèi)不精密度均小于5.0%，批間不精密度均小于6.7%，結(jié)果在可接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)。正確度評估采用原衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評的標(biāo)本和校準(zhǔn)品與靶值的分析比較，2014年的5個室間質(zhì)評標(biāo)本與靶值的偏倚在-3.03%～-1.41%范圍內(nèi)，校準(zhǔn)品的偏倚為-1.56%，滿足實驗室的要求。

可報告范圍驗證通常采用配制包含不同分析物濃度的系列標(biāo)本進行檢測，將按稀釋比例計算的預(yù)期值和實測值設(shè)置為2個變量，做線性回歸：回歸直線應(yīng)當(dāng)為過原點、斜率為1的直線，直線所達的限值即為結(jié)果的檢測可報告范圍[6]。本室選用室間質(zhì)評標(biāo)本高值(761 U/L)、低值(20 U/L)，按比例配制成6個濃度的系列標(biāo)本進行檢測，得到回歸方程為Y=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4)。截距a和斜率b通過t檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，沒有產(chǎn)生實質(zhì)性偏倚。用蒸餾水檢測的可報告范圍為1.17～757.70 U/L，在廠家檢測蒸餾水的線性范圍內(nèi)(10.0～800.0 U/L)，可以認為該檢測范圍內(nèi)結(jié)果的報告范圍可靠。

本研究討論的生物學(xué)參考區(qū)間，檢測了160份經(jīng)獻血前初篩和復(fù)檢合格的獻血者標(biāo)本，測得生物學(xué)參考區(qū)間為0.0～32.7U/L，并以其作為獻血人群的參考區(qū)間[7]。測量不確定度是指表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[8]。測量不確定度的評估可在中間精密度條件下通過測量質(zhì)控物獲得的量值進行計算，這些條

件包括了測量程序標(biāo)準(zhǔn)操作中盡可能多而合理的常規(guī)變化，如不同批次試劑和校準(zhǔn)物、不同操作者和定期儀器維護[1]。本室做了試劑、校準(zhǔn)品、儀器的不確定度值，計算出Uc，得到擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度，最終確定不確定度報告為(74.90±3.32)U/L。不確定度值是實驗室測量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)[9]，被測量值的不確定度越小，測量質(zhì)量越高[10]。依據(jù)試劑、校準(zhǔn)品和儀器的不確定度的分量值，校準(zhǔn)品分量占的比例最大，提醒研究者要選擇質(zhì)量可靠的校準(zhǔn)品，以提高檢測質(zhì)量。

通過對檢測方法的確認，目的是為提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確度的問題是實驗室一項全面質(zhì)量管理體系的問題。它不僅是一項單純、具體的技術(shù)工作，而且也是實驗室的管理內(nèi)容，如科學(xué)嚴謹?shù)墓芾碇贫取⒄_的操作規(guī)程，以及檢驗人員的職業(yè)道德、業(yè)務(wù)素質(zhì)等。檢測結(jié)果準(zhǔn)確度的保證貫穿檢驗過程的始終，包括抽樣、制樣、試驗、數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析等，直到出具檢驗報告為止。因此還必須按ISO9000系列標(biāo)準(zhǔn)以及ISO15189的要求，建立起完善健全的實驗室質(zhì)量管理體系，以確保實驗室的管理要求和技術(shù)要求。

[1]中國合格評定國家認可委員會.ISO15189 醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則[S].北京：中國合格評定國家認可委員會，2008.

[2]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL38醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在臨床化學(xué)檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S].北京：中國合格評定國家認可委員會，2012.

[3]孟凡云,丁玉娟,王夕剛.《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2012版)研讀[J].中國醫(yī)藥指南,2013,10(9):397-398.

[4]王治國．臨床檢驗方法確認與性能驗證[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：160-176．

[5]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計量司．測量不確定度評定與表示指南[M]．北京：中國計量出版社，2005：115-163．

[6]金寧娟,王惠民.不同線性評價方法在臨床化學(xué)測量中的應(yīng)用[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2015，36(23):3423-3425.

[7]衛(wèi)生部臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會.WS/T407-2012臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定[S].北京:衛(wèi)生部臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會,2013.

[8]王治國．臨床檢驗質(zhì)量控制技術(shù)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：22-54．

[9]陳文祥，申子瑜，楊振華．臨床檢驗中的測量不確定度[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(9)：967-971．

[10]汪子偉．臨床實驗室的量值溯源和測量不確定度估計[J]．現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2009，21(8)：797-798．

Confirmation of ALT detection method

ZENGFufang,WUDan,ZHOUJi，TIANFang,PENGDongju

(ShiyanMunicipalBloodCenter，Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo confirm the performance of rate method for detecting ALT in blood donors to verify that it meets the requirements of ISO15189.Methodsaccording to the requirements of CNSA-CL02:2012 the Medical Laboratory Quality and Ability Recognized Standards and the Blood Station Technical Operation Regulations(edition 2012),the precision,accuracy,sensitivity,reportable range,biology reference interval and measurement uncertainty of the detection system were verified.ResultsThe intra-batch imprecision for the ALT quality control serum and 2 concentrations of blood donor sample detected for 20 times and 20 d was<5.0% and the inter-batch imprecision was <6.7%;the correct estimates passed the external quality assessment results of the original Ministry of Public Health in 2014 and calibration results analysis.The relative bias was less than 1/2 of CLIA′88 permissible error;the regression equation of reportable range obtained by the linear regression wasY=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4),the results within the detection range were correct;the biological reference interval was 0.0-32.7 U/L and the measurement uncertainty was (74.90±3.32)U/L.ConclusionThe performance indexes of ALT detection method conform to the expected requirements of ISO15189.This method can be used as a blood screening test method in laboratory.

alanine aminotransferase；confirm；performance verification

曾付芳，女，主管技師，主要從事輸血相關(guān)傳染病防治研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.019

A

1673-4130(2016)17-2406-03

2016-04-03

2016-06-11)