單核苷酸多態(tài)性（SNP）在近交系小鼠遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用

趙麗亞， 張 蓉， 趙 瑩， 邢正弘， 陳國(guó)強(qiáng)（1. 上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 上海 201203； 2. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 上海 201203）

單核苷酸多態(tài)性（SNP）在近交系小鼠遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用

趙麗亞1，2， 張 蓉1，2， 趙 瑩1，2， 邢正弘1，2， 陳國(guó)強(qiáng)1，2
（1. 上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 上海 201203； 2. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 上海 201203）

目的 利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)構(gòu)建多重聚合酶鏈反應(yīng)和鏈接酶反應(yīng)（PCR-LDR）方案，為近交系小鼠的遺傳檢測(cè)提供一種快速、簡(jiǎn)便的方法。方法 在SNP公共數(shù)據(jù)庫中挑選51 個(gè)SNP位點(diǎn)，該51個(gè)位點(diǎn)分布于每條常染色體和性染色體，共分為5組，進(jìn)行多重PCR-LDR方案構(gòu)建，并將該方案作為遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法對(duì)采集的7個(gè)近交系樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 在送檢的7個(gè)近交系小鼠樣本中，純合度都為100%，相同來源相同品系小鼠的遺傳背景一致，但在不同單位的近交系小鼠中，某些SNP位點(diǎn)有差異，CBA/Ca/BKl和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果不同，C57BL/6/BKl和C57BL/6JSlac在c7、c10位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果不同。另外，兩家公司各有5個(gè)位點(diǎn)在所有品系中基因型相同，因此有效位點(diǎn)數(shù)各為46個(gè)。結(jié)論 構(gòu)建的多重PCR-LDR方案能有效對(duì)兩家動(dòng)物生產(chǎn)單位的近交系小鼠進(jìn)行檢測(cè)，可用于常見近交系小鼠快速、高通量的基因分型，有利于大規(guī)模遺傳質(zhì)量檢測(cè)和品系鑒定。

遺傳質(zhì)量檢測(cè)； 近交系小鼠； 單核苷酸多態(tài)性（SNP）； 多重聚合酶鏈反應(yīng)和鏈接酶反應(yīng)（PCR-LDR）； 分型方案

隨著C57BL/6及其它近交系［1，2］序列測(cè)序的完成，發(fā)現(xiàn)了大量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms， SNP），SNP多態(tài)性及低檢測(cè)費(fèi)用為遺傳鑒定提供了有利條件。2001年Grupe等［1］利用SNP檢測(cè)了15個(gè)品系， 2002年Wade等［2］利用SNP 從15個(gè)品系中檢測(cè)出4個(gè)品系是多態(tài)性， 2012年Cui等［3］利用SNP檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)小鼠的遺傳狀態(tài)， 2004年P(guān)etkov等［4］從235個(gè)SNPs中挑選28個(gè)SNPs用于鑒定48個(gè)小鼠品系。SNP數(shù)目多、分布廣， 遍布整個(gè)基因組， 具有遺傳穩(wěn)定性，SNP單核苷酸突變率為10-9。另外，SNP基因型分析特別適合模型動(dòng)物的遺傳純度分析，等位基因位標(biāo)包含了近交系小鼠中的所有信息，某些位于基因內(nèi)部的SNP變異有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，因此SNP可用于描述近交系小鼠的遺傳狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇7個(gè)品系SPF級(jí)成年近交系小鼠，分別是上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（以下簡(jiǎn)稱BK公司）［SCXK（滬）2008-0016］提供的C57BL/6/BKl、C3H/He/BKl、FVB/NJ/BKl、BALB/c/BKl、DBA/2/ BKl、CBA/Ca/BKl、129/SvEvBrd/BKl和上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（以下簡(jiǎn)稱BK公司）［SCXK（滬）2012-0002］提供的C57BL/6JSlac、C3H/HeJSlac、FVB/NJSlac、BALB/cAnSlac、DBA/2JSlac、CBA/JSlac，129S1/SVImJSlac， 每個(gè)品系分別從繁殖群和種子群中取雌雄各3～4只，兩家公司的繁殖群樣本都為56個(gè)，種子群樣本分別為55個(gè)和54個(gè)，共221個(gè)樣本。上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的動(dòng)物來源于英國(guó)BK公司，在國(guó)內(nèi)繁殖了約14代。上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的動(dòng)物來源于Jackson實(shí)驗(yàn)室，在國(guó)內(nèi)繁殖了約24代。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）， 從成年小鼠尾尖剪取0.5 cm組織用于抽取全基因組DNA，剪取的組織包括骨、血管、皮膚等各種組織，抽提產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后在Tanon-3500全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描，有結(jié)果時(shí)，可以作為模板用于后續(xù)的多重PCR擴(kuò)增，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNP位點(diǎn)引物與探針設(shè)計(jì) 從NCBI（National Center for Biotechnology Information）進(jìn)入小鼠SNP公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)提供的小鼠品系，在每條染色體上選取1～3個(gè)SNP（short tandem repeat）位點(diǎn)，共挑選SNP位點(diǎn)51個(gè)［5］。

根據(jù)挑選的SNP序列，分別設(shè)計(jì)引物和探針，用primer3在線軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）設(shè)計(jì)引物，選擇性擴(kuò)增包含SNP位點(diǎn)的不同染色體區(qū)段。多重引物設(shè)計(jì)主要借助Oligo6.0程序（Molecular Biology Insights Inc.， USA）完成，同時(shí)將PCR-LDR產(chǎn)物的范圍設(shè)計(jì)在78～131 bp，每組內(nèi)各位點(diǎn)差異2 bp， 共設(shè)計(jì)引物和探針51對(duì)，將51對(duì)引物和探針分為5組，第1組為10個(gè)位點(diǎn)，第2組、第3組、第4組為12個(gè)位點(diǎn)，第5組為5個(gè)位點(diǎn)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1、表2， 表中列出第一組的引物和探針序列，其余4組未列出引物和探針，只在結(jié)果中附圖）。

表 1 第一組PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Genome primer sequences of the first group

1.2.3 PCR及LDR程序 PCR反應(yīng)體系（10 μL體系）: 10×PCR緩沖溶液1 μL， GC 1μL， 25 mmol/L，Mg2+1.2 μL， 200 μmol/L的dNTP混合液（各2.5 mmol/L）0.8 μL， 各0.5 μmol/L的引物1 μL， 5個(gè)單位/μL熱啟動(dòng)DNA聚合酶（AmpliTaq Gold?360 DNA Polymerase）0.05 μL， 3～5 ng/μL的模板DNA 1 μL，加水補(bǔ)足10 μL。

反應(yīng)程序: 95 ℃ 15 min； 94 ℃ 30 s→50 ℃～65 ℃90 s→ 72℃ 1 min， 共35個(gè)循環(huán)； 72℃ 10 min； 10 ℃持續(xù)。其中第1組、第2組、第5組引物的退火溫度為56 ℃， 第3組引物的退火溫度為58℃， 第4組引物的退火溫度為60 ℃。

表 2 第1組LDR探針序列Table 2 Genome probe sequences of the first group

LDR反應(yīng)體系（10 μL體系）: 10× 緩沖溶液1 μL，各0.5 μmol/L的位點(diǎn)特異探針1 μL，模板（PCR產(chǎn)物）4 μL，40 U/μL Taq DNA鏈接酶0.1 μL，加水補(bǔ)足10 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s→50 ℃2 min，共30個(gè)循環(huán)；10℃ 持續(xù)。

1.2.4 多重PCR-LDR方案構(gòu)建 取C57BL/6小鼠構(gòu)建多重PCR-LDR方案，本實(shí)驗(yàn)的多重PCR-LDR方案構(gòu)建依據(jù)：①各LDR產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，相隔2 bp。②不同PCR引物或探針之間不發(fā)生相互作用以致影響某些PCR引物或探針的正常反應(yīng)。因此將51個(gè) SNP位點(diǎn)合理的分為5組，而后對(duì)每一組分別優(yōu)化PCR反應(yīng)溫度、各引物間濃度比、各探針間濃度比等條件，使每組中所有位點(diǎn)都能被檢測(cè)出來，最后用5組PCR-LDR方案對(duì)待檢樣本進(jìn)行檢測(cè)。該方法可將原來的11 271個(gè)反應(yīng)過程縮減為1 105個(gè)PCR-LDR反應(yīng)過程。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖電泳，電壓20 V/cm， 泳動(dòng)方向：負(fù)極→正極， 泳動(dòng)時(shí)間：40 min。溴化乙錠（15 μg/mL）染色，紫外燈下觀察， 拍照。

利用ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystems Inc.， 美國(guó)）對(duì)PCR-LDR連接產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。具體過程是將1.0 μL LDR連接產(chǎn)物、1.0 μL ROX分子量標(biāo)準(zhǔn)和8 μL HIDI混勻后，95 ℃，5 min變性，立刻置冰水浴5 min，然后通過ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，每輪分析48個(gè)樣本，每輪運(yùn)行時(shí)間為900 s。通過GeneMapperID v3.2軟件分析可將各種激光標(biāo)記的DNA電泳帶轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的掃描吸收峰。再通過與已知分子量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參比較，確定LDR連接產(chǎn)物大小。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因組DNA抽取

根據(jù)動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，挑選部分品系的抽提產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后在Tanon-3500全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描（圖1），有結(jié)果時(shí)，可以作為模板用于后續(xù)的多重PCR擴(kuò)增。

M: Marker； 第1道至第5道分別為C57BL/6/BKl、C3H/ He/BKl、FVB/NJ/BKl、BALB/c/BKl、DBA/2/BKl圖 1 基因組DNA 檢測(cè)結(jié)果Figure 1 The results of genomic DNA

2.2 多重PCR-LDR方案構(gòu)建

取本實(shí)驗(yàn)室中的C57BL/6/BKl為模板，構(gòu)建多重PCR-LDR方案，最終將51個(gè)SNP位點(diǎn)組合為5組進(jìn)行多重PCR-LDR擴(kuò)增，第1組為10個(gè)位點(diǎn)（圖2A），第2組、第3組、第4組為12個(gè)位點(diǎn)（圖2B， C， D）， 第5組為5個(gè)位點(diǎn)（圖2E）。PCR-LDR結(jié)果表明，C57BL/6/BKl小鼠DNA在目標(biāo)SNP位置均為單峰，表明其為純合子。

2.3 近交系小鼠遺傳檢測(cè)

在送檢的7個(gè)近交系中，采用51個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)，其純合度都為100%，相同來源相同品系的SNP狀態(tài)完全一致，但在不同單位的近交系小鼠中，某些位點(diǎn)有差異，主要有差異的品系及位點(diǎn)是：CBA/Ca/BKl和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果不同，C57BL/6/BKl和C57BL/6JSlac在c7、c10位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果不同（表3）。

2.4 SNP位點(diǎn)在品系間的差異分析

品系間兩兩比較見表4、表5，BK公司各品系間最大差異位點(diǎn)數(shù)為30個(gè)，最小差異位點(diǎn)數(shù)為7個(gè)， 平均差異位點(diǎn)數(shù)為23個(gè)。SLAC公司各品系最大差異位點(diǎn)數(shù)為31個(gè)， 最小差異位點(diǎn)數(shù)為1個(gè)，平均差異位點(diǎn)數(shù)為23個(gè)。另外， 兩家公司各有5個(gè)位點(diǎn)在所有品系中基因型相同，分別為a4、b11、c7、c8、d9和a4、b11、c8、d9、e2，因此有效位點(diǎn)數(shù)各為46個(gè)。

3 討論

在醫(yī)學(xué)生物研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性、可重復(fù)性和準(zhǔn)確性有著重要影響。在長(zhǎng)期保種、育種過程及繁殖生產(chǎn)中，近交系動(dòng)物可能發(fā)生遺傳污染或遺傳突變、漂變，從而影響相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性、可靠性。所以加強(qiáng)對(duì)近交系小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期、有效、嚴(yán)格、定時(shí)的遺傳學(xué)檢測(cè)非常重要。近交系小鼠傳代中產(chǎn)生變異的主要原因有基因突變以及遺傳污染。本研究提出利用多重PCR-LDR基因分型方案，多個(gè)位點(diǎn)可以在同一體系內(nèi)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增、LDR連接與分型，從而降低了費(fèi)用。另外，通過對(duì)7個(gè)品系的近交系小鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè)，構(gòu)建一種可檢測(cè)近交系小鼠的方案，可一次性檢測(cè)所有待檢樣本，并可進(jìn)行品系間鑒定，有利于動(dòng)物生產(chǎn)單位的近交系小鼠常規(guī)遺傳檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用51個(gè)SNP位點(diǎn)較全面的反應(yīng)了小鼠的遺傳背景。將這51個(gè)SNP位點(diǎn)在7個(gè)品系小鼠中的連接產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果各品系基因純合度都為100%，說明其在傳代中沒有出現(xiàn)變異現(xiàn)象。但兩家公司的CBA/Ca/BKl和CBA/JSlac在a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果不同，C57BL/6/BKl和C57BL/6JSlac在c7、c10位點(diǎn)的遺傳檢測(cè)結(jié)果不同。原因可能是兩家公司動(dòng)物來源不同，亞系不同。據(jù)報(bào)道， 2009和2015年Mekada等［6，7］利用SNP檢測(cè)C57BL/6的不同亞系，因來源不同，其基因型有差別， 2011年Zurita等［8］利用1 449個(gè)SNP檢測(cè)了C57BL/6的不同亞系，本文的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

圖 2 PCR-LDR分型方案的毛細(xì)管電泳圖Figure 2 The capillary electrophoresis of products by PCR-LDR

表 3 近交系小鼠遺傳檢測(cè)結(jié)果Table 3 The result of genetic monitoring of inbred mice

表 4 BK公司小鼠SNP位點(diǎn)品系間差異Table 4 The difference of SNPs in mouse from BK Co. strains

表 5 SLAC公司小鼠SNP位點(diǎn)品系間差異Table 5 The difference of SNPs in mouse from SLAC Co. strains

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明各品系小鼠在某些位點(diǎn)表現(xiàn)一致，如a4、b11、c7、c8、d9或a4、b11、c8、d9、e2在所有品系中的基因型都相同，反應(yīng)出小鼠品系間有相近的親緣關(guān)系，而在某些位點(diǎn)的不同結(jié)果也體現(xiàn)出了不同品系的特異性。另外，兩個(gè)公司品系間兩兩比較后，平均差異位點(diǎn)數(shù)都為23個(gè)。因此，通過對(duì)7個(gè)品系的近交系小鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè)，得到一種可檢測(cè)近交系小鼠的方案，可一次性檢測(cè)所有待檢樣本，并可進(jìn)行品系間鑒定。該方案不僅節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間及成本，更有利于對(duì)大規(guī)模樣本的檢測(cè)，將會(huì)擁有更加廣闊的發(fā)展前景。

［1］ Grupe A， Germer S， Usuka J， et al. In silico mapping of complex disease-related traits in mice［J］. Science， 2001， 292（5523）: 1915-1918.

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Application of Single Nucleotide Polymorphism Genotyping Panel in Genetic Monitoring of Laboratory Mice

ZHAO Li-ya1， ZHANG Rong1， ZHAO Ying1， XING Zheng-hong1， CHEN Guo-qiang1
（1. Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China；
（2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai 201203， China）

Objective To develop multiple PCR-LDR genotyping protocols for monitoring genetic contamination in inbreed mice in a fast and reliable way. Method In total 51 single nucleotide polymorphisms （SNPs） from public SNP database were chosen and divided into five groups. These 51 SNPs are wildly distributed and there are least one SNP on each autosomal chromosome and the sex chromosome. A multiple PCR-LDR genotyping protocol was established as a genetic quality control approach to monitor the genotypes of 7 inbred mice. Results The homozygosity is 100% for the 7 tested mice. The genetic background of the inbred mice from the same source is identical. For the same inbred mice from different companies， several SNPs are different. The SNPs are different at a9、a10、b5、b9、c1、c12、e1、e2 for CBA/Ca/Bkl and CBA/JSlac， while the SNPs are different at c7， c10 for C57BL/ 6/BKl and C57BL/6JSlac. However， there are five loci which are the same in the 7 inbred mice of different companies. So there are 46 effective loci which are different in the 7 inbred mice of different companies. Conclusion The multiple PCR-LDR genotyping protocol is used to monitor the genetic differences of inbred mice from two companies. The results of this study provide a rapid and highthroughput genotyping approach， which is sufficient for genetic contamination monitoring and strain identification.

Genetic quality monitoring； Inbred mice； Single Nucleotide Polymorphisms （SNP）；multiple PCR-LDR； Genotyping protocol

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0024-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.005

2015-06-29

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（12140900400）

趙麗亞（1981-）， 女， 碩士。研究方向: 分子遺傳學(xué)。E-mail: zhaoliya3002@163.com

趙 瑩（1982-）， 女， 碩士， 助理研究員。研究方向:群體遺傳學(xué)及藥物毒性安全評(píng)價(jià)。E-mail: 12414863@qq.com