應用通用熒光引物篩選裸鼴鼠微衛星位點方法的建立

林麗芳， 李 莉， 肖 邦， 程繼帥， 楊文靜， 叢 薇， 趙善民， 湯 球， 崔淑芳（. 第二軍醫大學實驗動物中心， 上海 00433； . 第二軍醫大學教學保障處， 上海 00433）

應用通用熒光引物篩選裸鼴鼠微衛星位點方法的建立

林麗芳1， 李 莉2， 肖 邦1， 程繼帥1， 楊文靜1， 叢 薇1， 趙善民1， 湯 球1， 崔淑芳1
（1. 第二軍醫大學實驗動物中心， 上海 200433； 2. 第二軍醫大學教學保障處， 上海 200433）

目的 建立使用通用熒光引物分步PCR法篩選裸鼴鼠微衛星位點的方法。方法 在特異性引物F鏈的5’端連接通用引物，先以特異引物R鏈和加長引物F鏈進行PCR，再加入通用熒光引物進行第二步PCR，最后使用瓊脂糖電泳和毛細管電泳檢測擴增產物，同時以傳統的熒光引物PCR為對照。結果 瓊脂糖電泳結果顯示，通用熒光引物PCR產生的目的片段清晰，引物特異性強，目的片段多態性與傳統PCR產生的多態性一致，且片段大小均比傳統PCR產生的目的片段大15 bp左右，與預期一致。毛細管電泳結果也顯示，通用引物PCR結果檢測的等位基因數與傳統熒光引物PCR方法產生的數量完全一致，無雜帶，擴增效率高，具有較強的可操作性。結論 使用通用熒光引物分步PCR法結果可應用于裸鼴鼠基因組大量微衛星位點的篩選。

裸鼴鼠； 微衛星位點篩選； 通用熒光引物； PCR

裸鼴鼠作為一種新型實驗動物， 近年來得到國際上廣泛重視［1-5］， 但對其遺傳學研究目前報道較少。遺傳背景清晰是裸鼴鼠實驗動物化的重要前提，因此，裸鼴鼠的遺傳學研究迫在眉睫，尤其是分子遺傳學研究。但至今為止報道［6］的關于裸鼴鼠的微衛星位點僅12個，遠遠不能滿足裸鼴鼠的遺傳多態性鑒定需要。因此近年來本實驗室在建立裸鼴鼠封閉群并進行一系列生物學特性研究的基礎上［7-10］，進一步篩選裸鼴鼠高度多態性微衛星位點，以期建立裸鼴鼠的遺傳學檢測標準，為裸鼴鼠的遺傳學檢測奠定基礎。

微衛星位點檢測方法目前有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳。其中毛細管電泳最為靈敏， 且可實現高通量檢測， 操作過程相對簡單， 結果可靠， 是判斷的最終標準。但是篩選高度多態性微衛星位點以及鑒別個體的基因多態性過程中， 需要標記每對熒光引物，產生巨額的費用。此外，若位點的多態性低不具代表性，該引物將被淘汰，造成一定的浪費。因此， Schuelke［11］采用通用熒光引物PCR的方法解決了基因分型的問題。

通用引物PCR的原理是: 在特異性引物F鏈的5’端加一段通用序列， 經過多個PCR循環后， 目的片段將帶有通用序列及其互補序列。此時， 再將產物與通用熒光引物進行PCR反應，終產物片段將標記上熒光， 因此可以通過該熒光信號進行PCR檢測。該方法很大程度上節省了實驗費用，但已報道的研究主要針對物種的基因分型，未涉及通用熒光引物在微衛星位點篩選的應用。本研究在應用通用熒光引物的基礎上，調整PCR循環， 使用分步PCR方法，可操作性強，且具有較高的經濟效益，適用于裸鼴鼠的微衛星位點篩選。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年裸鼴鼠由第二軍醫大學實驗動物中心繁殖。

1.2 儀器及試劑

主要儀器有毛細管電泳儀、PCR儀、高速低溫離心機、恒溫干燥箱、分光光度計等。主要試劑有基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN，美國），PCR試劑盒（TAKARA，大連寶生物），毛細管檢測試劑盒（Beckman，美國），DL2000 DNA Marker、瓊脂糖等均購自上海生工生物公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及基因組DNA提取 隨機從裸鼴鼠群落中抽樣10只裸鼴鼠， 雌性各半， 年齡為7～10月齡， 各剪取約1 cm長尾尖部， 使用基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取， 作為下一步的PCR模板。

1.3.2 引物設計 引物由通用引物和特異性引物兩部分構成。通用引物U為: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'（5'標記FAM熒光）； 特異性引物則通過NCBI的Genbank，隨機查找具有多重復核苷酸序列的位點，以重復核苷酸序列為核心區域，使用PRIMER5軟件進行引物設計， 在特異F鏈引物5'端連接通用引物U: U-F（無需標記熒光）。同時對照組為傳統PCR，引物為特異性引物F鏈和R鏈。所有引物委托上海生工生物公司合成（表 1）。

1.3.3 通用熒光引物PCR檢測 本實驗使用兩步的PCR進行檢測。第一步將裸鼴鼠基因組DNA作為PCR模板， 以特異性引物R鏈和U-F鏈為引物進行PCR。PCR反應體系為25 μL， 各組分的終濃度為: 0.05 U Taq 多聚酶/μL， 250 μmol/L dNTP， 50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 特異性引物（R鏈，U-F鏈）0.2 μmol/L， 0.5 μL DNA模板（30～60 ng）。PCR反應程序: 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 退火溫度30 s， 72 ℃ 30 s，35個循環； 72 ℃ 10 min。第二步，PCR結束后在PCR反應液中加入0.4 μL的通用引物U（10 μmol/L）， 混勻后進行第二步的PCR。PCR反應程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃30 s，8個循環； 72 ℃ 10 min。

同時以普通PCR為對照，引物為特異性引物R鏈和F鏈。反應體系為25 μL，各組分的終濃度為：0.05 U Taq 多聚酶/μL，250 μmol/L dNTP，50 mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 特異性引物（R鏈，F鏈）0.4 μmol/L， 0.5 μL DNA模板（30～60 ng）。PCR反應程序: 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，35個循環； 72 ℃ 10 min。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測 本研究將10個基因組DNA樣本混合作為PCR模板，分別使用通用引物PCR和傳統PCR檢測不同位點對應的引物5-7、58-1、57-1、54-2、4-8，終產物分別于3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，上樣量為質量分數10 μL，電泳條件為: 30 min，120 V。

1.3.5 毛細管電泳檢測 基于前期的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，本實驗針對裸鼴鼠位點對應的引物3-81，分別以5個不同裸鼴鼠個體的基因組DNA為模板，使用傳統熒光引物PCR方法（F鏈5'端標記FAM熒光）和通用熒光引物PCR法進行位點擴增，PCR產物毛細管電泳檢測分析。具體檢測步驟為: 將PCR產物稀釋10倍，稀釋后的PCR產物加入加樣板，在每個樣中加入上樣緩沖液（SLS，甲酰胺）以及分子量內標， 使用毛細管電泳儀（Beckman P/ACEMDQ）進行檢測。設定STR方法（溫度50 ℃； 進樣2.0 kV， 30 s； 電泳5.0 kV， 62 min）進行電泳檢測。熒光信號收集完畢后，用CEQ分析軟件自動統計分析，并讀取峰值大小和峰值位置。

表 1 引物序列

2 結果

2.1 瓊脂糖電泳檢測結果

以基因組DNA混合樣本為模板，以引物5-7、58-1、57-1、54-2、4-8分別進行通用熒光引物PCR和傳統PCR。瓊脂糖電泳結果顯示，通用熒光引物PCR產生的目的片段清晰，條帶數量與傳統PCR產生的片段數量一致，引物特異性強， 目的片段大小均比傳統PCR產生的目的片段大15 bp左右，結果可靠，具有較強的可操作性，該方法可應用于裸鼴鼠基因組大量微衛星位點的篩選（圖 1）。

2.2 毛細管電泳檢測結果

本實驗針對裸鼴鼠位點對應的引物3-81， 分別使用傳統熒光引物PCR方法（F鏈5'端標記FAM熒光）和通用熒光引物PCR法對5個不同裸鼴鼠個體的基因組進行位點擴增后， 毛細管電泳檢測。結果顯示， 通用引物PCR產生的等位基因數與傳統熒光引物PCR方法產生的數量完全一致， 無雜帶， 擴增效率較高， 可用于裸鼴鼠微衛星位點的篩選（圖2）。

3 討論

本研究建立的分步通用熒光引物PCR方法從PCR反應體系以及PCR反應程序上都進行了調整，與Schuelke［11］報道的方法比較，更適用于裸鼴鼠的微衛星位點篩選。同時，一條通用熒光引物可用于所有的位點篩選，避免了大量熒光引物的合成，可節約大量費用。

通用熒光引物的設計，決定了該PCR方法的可行性。通用熒光引物設計的原則為: 與裸鼴鼠基因組無同源性、引物長度在15～30 bp范圍內、引物自身不形成發夾結構以及二聚體等［12］。本實驗引用Schuelke于2000年報道的通用引物［11］，經驗證，該通用引物與裸鼴鼠基因組無同源性，適用于裸鼴鼠微衛星位點的篩選。

本實驗使用分步的PCR循環，結果比連續的PCR循環更為穩定可靠。本實驗先根據特異引物的最佳退火溫度進行35個循環的PCR后，再加入通用引物，進行8個循環的擴增。瓊脂糖電泳和毛細管電泳結果都與預期一致，結果穩定可靠。Schuelke［11］報道的通用熒光引物PCR方法中，將特異性引物和通用引物置于同一體系，兩次的PCR循環連續進行。本研究顯示將特異性引物和通用引物置于同一體系檢測結果穩定性較差，部分引物的特異性降低，可能是通用引物的退火溫度與特異性引物的退火溫度較為接近，影響特異性引物的特異性擴增。而裸鼴鼠微衛星位點的篩選由于位點數量多、引物退火溫度范圍廣、引物長度多樣性高，對通用熒光引物PCR的體系及PCR程序要求較高。

圖 1 不同微衛星位點的通用熒光引物和傳統熒光引物PCR的瓊脂糖電泳

本研究中瓊脂糖電泳及毛細管電泳檢測結果均表明，通用熒光引物分步PCR法對微衛星位點多態性的分析結果與傳統熒光引物PCR方法一致。理論上，通用引物長為18 bp，因此，通用引物PCR產生的片段大小比傳統PCR產生的片段大18 bp。從瓊脂糖電泳的結果可見兩者產生的片段多態性、條帶清晰度一致，前者產生的片段比后者片段大約15 bp，符合預期。而進一步的毛細管電泳結果也顯示，兩種方法檢測同一樣本的同一位點，產生的片段多態性一致，通用引物PCR產生的4個等位基因片段比傳統PCR產生的片段長度均長16 bp，與預期的18 bp小，可能是PCR過程結束時末端加堿基A所導致或者不同批次檢測內標的差異引起，但是不影響對微衛星位點多態性的分析及篩選。

圖 2 傳統熒光引物和通用熒光引物PCR方法的毛細管電泳

通用熒光引物PCR法節省了大量的實驗成本，具有巨大的應用價值。檢測成本高是目前制約實驗動物微衛星遺傳檢測方法廣泛應用的制約因素之一，其中熒光引物合成費用在檢測費用中占很大的比例。因此，通用熒光引物PCR方法的使用將在很大程度上降低檢測成本。

本研究建立的通用熒光引物PCR法結果表明，熒光通用引物分步PCR法結果穩定可靠，能真實反映位點的多態性，檢測效率高、很大程度地節省了熒光引物的合成費用，具有較高的應用價值，適用于裸鼴鼠多態性微衛星位點的篩選。

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Establishment of PCR Method Using Fluorescence Labeled Universal Primers for Screening Microsatellite Loci in Naked Mole Rat

LIN Li-fang1， LI Li2， XIAO Bang1， CHENG Ji-shuai1， YANG Wen-jing1，CONG Wei1， ZHAO Shan-min1， TANG Qiu1， CUI Shu-fang1
（1. Laboratory Animal Center， 2. Teaching Guarantee Department，Second Military University， Shanghai 200433， China）

Objective Fluorescent labeled universal primers PCR in two-steps was established to screen microsatellite loci of naked mole rat. Methods A fusion of the forward primer and universal primers in 5' end was created. The first PCR was conducted with reverse primers and forward primer extended with universal primers. The second PCR was initiated after the adding of fluorescent labed universal primers. With conventional fluorescent labeled primers PCR as a control， PCR product was detected by agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis. Results Fluorescent labeled universal primer PCR had strong specificity and bands in agarose gel electrophoresis was sharp. Furthermore， the product had high consistent polymorphism with those in traditional PCR， with size being about 15 bp. They were in line with expectations. After analysis of capillary electrophoresis， it also showel equal number of allele with these two different method. As well， this fluorescent labeled universal primer PCR had high amplification efficiency and being specific， operational. Conclusion The fluorescent labed universal primers PCR in two-steps was applicable to screen a high-flux of microsatellite loci in naked mole rat.

Naked mole rat； Screening microsatellite loci； Fluorescent labeled universal primers； PCR

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0076-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.016

2015-12-14

上海市科技發展基金項目（12140900400）與國家科技支撐計劃項目（2015BAI09B02）聯合資助

林麗芳（1986-）， 女， 助教。E-mail: linlifang2012@126.com

崔淑芳， 教授。E-mail: youngstar_sf@163.com