小鼠感染大腸桿菌O127∶H6腸炎模型的建立及受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌活性因子的表達(dá)

范君文， 隋麗華， 許 琴， 劉 一， 劉慧芳， 孫兆增， 閆 亮（. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 北京 0007； . 解放軍0醫(yī)院健康體檢中心， 北京 0009；. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科， 烏魯木齊 80000）

·論 著·

小鼠感染大腸桿菌O127∶H6腸炎模型的建立及受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌活性因子的表達(dá)

范君文1， 隋麗華1， 許 琴3， 劉 一1， 劉慧芳1， 孫兆增1， 閆 亮2
（1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 北京 100071； 2. 解放軍302醫(yī)院健康體檢中心， 北京 100039；
3. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科， 烏魯木齊 830000）

目的 探討大腸桿菌O127∶H6 （Escherichia coli O127∶H6）感染BALB/c小鼠建立腸炎模型及其受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌活性因子（RANTES）與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。方法 通過(guò)不同劑量大腸桿菌O127∶H6灌胃的方式，建立腸炎小鼠模型（實(shí)驗(yàn)組），灌胃生理鹽水為對(duì)照組。取小鼠空腸標(biāo)本，石蠟包埋，HE染色，觀察病理變化； 采用熒光定量PCR的方法，測(cè)定不同劑量組感染小鼠空腸組織的RANTES表達(dá)情況。結(jié)果 成功建立了腸炎性小鼠模型，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，空腸有明顯的炎性病理變化； 熒光定量PCR結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組RANTES表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。 結(jié)論 通過(guò)灌胃大腸桿菌 O127∶H6的方式可以建立腸炎小鼠模型，其空腸部位具有明顯的病理變化； RANTES 表達(dá)量的變化可以作為評(píng)價(jià)小鼠腸炎的指標(biāo)之一。

大腸桿菌O127∶H6； 病理變化； 熒光定量PCR； 受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌活性因子（RANTES）

細(xì)胞趨化因子（chemokine）與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，通常由70～90個(gè)氨基酸組成， 幾乎所有的趨化因子都含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，根據(jù)半胱氨酸的數(shù)量和位置將其分為以下4種類型: CXC型、CC型、C型、CX3C型。受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌活性因子（regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）屬于CC型，作為急慢性炎癥的重要介質(zhì)，其表達(dá)水平的提高是炎癥反應(yīng)的特征之一，與多種炎性疾病有關(guān)，如關(guān)節(jié)炎、銀屑病、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、腎小球腎炎、哮喘、炎癥性小腸炎等［1-6］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃的方式建立腸炎小鼠模型，觀察其小腸部病理學(xué)變化［7-10］，并利用熒光定量PCR的方法分析RANTES小腸組織的表達(dá)變化情況。探討小鼠腸炎模型的建立方法和模型有效性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌O127∶H6由本實(shí)驗(yàn)室保存； 清潔級(jí)BALB/c小鼠36只， 雌雄各半， 體質(zhì)量18～22 g， 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（軍）-2007-004］； 并在該中心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)［SYXK（軍）-2007-005］。小鼠感染O127∶H6后在P2實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜飼養(yǎng)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA）等購(gòu)自大連寶生物公司。引物由Invitrogen公司合成。核酸蛋白定量分析使用Thermo Nanodrop 2000。

1.2 方法

1.2.1 菌落計(jì)數(shù)和動(dòng)物模型建立 復(fù)蘇保存菌種O127∶H6涂布血平板， 挑取單菌落接種10 mL LB液體培養(yǎng)基， 37℃， 220 r/min培養(yǎng)9 h， 按體積分?jǐn)?shù)1%接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基， 37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)15 h， 稀釋后， 做平板記數(shù)， 計(jì)算原始菌液中的菌液濃度。3 000 r/min離心10 min收集菌體， 用生理鹽水稀釋成5個(gè)劑量組， 分別為5×107CFU/mL、2.5×108CFU/mL、5×108CFU/mL、2.5× 109CFU/mL、5×109CFU/mL。

36只小鼠隨機(jī)分成6組，禁食24 h后經(jīng)灌胃給予生理鹽水（對(duì)照組）和5個(gè)不同濃度的大腸桿菌，0.5 mL/只。每隔6 h觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)并記錄， 72 h后采集小腸組織， 一部分置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性多聚甲醛固定，用于病理檢查，一部分-80℃保存，用于提取RNA。

1.2.2 病理學(xué)檢查 取已固定的空腸組織， 常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片， HE染色， 鏡檢，拍照。

1.2.3 總RNA的提取及cDNA的合成 利用Trizol的方法提取總RNA，用Nanodrop 2000測(cè)定其濃度和A260/280值。cDNA合成按照試劑盒說(shuō)明書操作，總體積20 μL，-20 ℃保存。根據(jù)GenBank上公布的小鼠RANTES相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為: 5'-catatggctcggacacca-3'，下游引物序列為: 5'-acacacttggcggttcct-3'。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化 根據(jù)TAKARA公司提供試劑盒的反應(yīng)條件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性1 min， 94 ℃變性40 s， （50～62） ℃ 退火，40個(gè)循環(huán)做擴(kuò)增曲線； 95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、55 ℃循環(huán)133次（每隔0.3 ℃采集一次熒光信號(hào)）， 直到94.6 ℃， 做溶解曲線。在50～62 ℃確定RANTES 與gapdh最佳反應(yīng)退火溫度。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、樣品檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將標(biāo)準(zhǔn)品按1∶5倍比稀釋，按上述反應(yīng)體系及條件，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得RANTES與gapdh基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

優(yōu)化條件后對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)立陰性對(duì)照。運(yùn)用SASS軟件對(duì)樣品Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)72 h，對(duì)照組小鼠被毛光滑，精神良好，無(wú)異常糞便； 實(shí)驗(yàn)組小鼠被毛蓬亂，出現(xiàn)不同程度稀便。

2.2 組織病理學(xué)觀察

隨著菌液接種劑量的增加，空腸組織的病理變化越明顯。5×107CFU/mL組與對(duì)照組比較（圖1A），僅見(jiàn)空腸固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B），2.5× 108CFU/mL組空腸固有層血管充血，有較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1C），5×108CFU/mL組空腸固有層血管充血、有較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、部分上皮細(xì)胞水腫、脫落，結(jié)構(gòu)不清（圖1D），2.5×109CFU/mL組空腸固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)血管充血、黏膜下層有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜肌完整（圖1E），5×109組空腸固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分黏膜上皮細(xì)胞脫落（圖1F）。

2.3 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品按1∶5做5個(gè)濃度梯度倍比稀釋， 溶解曲線（圖2）有明顯單峰，且無(wú)雜峰，符合標(biāo)準(zhǔn)品要求。RANTES標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.378， r2為0.993，擴(kuò)增效率為97.7%； 內(nèi)參gadph斜率為-3.157，r2為0.996，擴(kuò)增效率為107.4%。由此可見(jiàn)，兩個(gè)基因擴(kuò)增效率良好，實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.4 RANTES表達(dá)結(jié)果

通過(guò)分析， RANTES的表達(dá)水平與O127∶H6劑量大小有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中， 對(duì)照組與5×107CFU/mL、2.5×108CFU/mL、5×108CFU/mL、2.5× 109CFU/mL組間沒(méi)有明顯差異， 與5×109CFU/mL組有明顯差異（P＜0.05）（圖3）。

3 討論

RANTES是β趨化因子中的一員，不僅對(duì)多種細(xì)胞有趨化作用，還可以強(qiáng)烈激活淋巴細(xì)胞，對(duì)T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的激活功能，能誘導(dǎo)多種炎癥因子大量表達(dá)［11］。

有研究表明［4，12］， RANTES在潰瘍性小腸炎串者病變組織中表達(dá)量升高； 胡建中等［13］通過(guò)ELISA方法檢測(cè)特應(yīng)性皮炎患者血清中RANTES水平顯著高于健康對(duì)照， 且與病情活動(dòng)呈正相關(guān)； 楊鉻華等［6］通過(guò)熒光定量PCR的方法同樣證實(shí)了RANTES mRNA的定量表達(dá)可以作為判斷患者病情程度的指標(biāo)之一。

A: 對(duì)照組（HE ×100）； B: 5×107CFU/mL組（HE ×400）； C: 2.5×108CFU/mL組 （HE ×100）； D: 5×108CFU/mL組（HE ×100）； E: 2.5×109CFU/mL組（HE ×100）； F: 5×109CFU/mL組（HE× 100）圖 1 不同濃度Escherichia coli O127∶H6感染BALB/c小鼠后空腸病理學(xué)變化A: control group （HE ×100）； B:group of 5×107CFU/mL（HE ×400）； C: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）； D: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）； E: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）； F: group of 2.5×108CFU/mL（HE ×100）Figure 1 The jejunal pathology of BALB/c mouse infected by different doses of Escherichia coli O127∶H6

A: RANTES標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； B: gapdh 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； C: RANTES溶解曲線； D: gapdh 溶解曲線圖 2 RANTES和gadph的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線A: linearity of the standard curves for RANTES； B: linearity of the standard curves for gadph；C: solubility curve of RANTES； D: solubility curve of gadphFigure 2 The standard curve and solubility curve of RANTES and gadph

1、2、3、4、5和N分別代表大腸桿菌O127∶H6 5個(gè)濃度組和對(duì)照組圖 3 不同組RANTES表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析1， 2， 3， 4， 5 and N represent 5 doses of Escherichia coli O127∶H6 groups and control group respectivelyFigure 3 The statistical analysis of RANTES expression in different groups

由于大腸桿菌 O157是腸出血性大腸桿菌，毒性和污染性較強(qiáng)，歷史上引發(fā)過(guò)嚴(yán)重的污染事件。大腸桿菌O157建立的腸炎模型［14］， 除了用于研究大腸桿菌O157本身感染機(jī)制、毒力和疫苗篩選，其癥狀也比較嚴(yán)重，常引起結(jié)腸固有層出血，是出血性結(jié)腸炎模型。而大腸桿菌O127∶H6是近年來(lái)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人類臨床研究中發(fā)現(xiàn)的具有致病性的一類大腸桿菌，可造成腸道腸壁通透性改變、間質(zhì)血管充血、黏膜下層有少量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥，病變發(fā)生在空腸，主要影響消化吸收功能，所以除了可研究大腸桿菌O127∶H6的感染機(jī)制，也可以應(yīng)用于開(kāi)發(fā)腸黏膜的消炎藥等。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腸炎動(dòng)物模型，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)腸炎模型小鼠RANTES的表達(dá)量，通過(guò)SASS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，證實(shí)腸炎小鼠RANTES指標(biāo)高于對(duì)照組小鼠，且與感染劑量呈正相關(guān)； 結(jié)合病理改變，隨著菌液接種劑量的增加，小腸黏膜固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、充血逐漸明顯， 部分上皮細(xì)胞水腫、脫落，結(jié)構(gòu)不清；進(jìn)一步證實(shí)了腸炎模型建立的可靠性，也為熒光定量PCR檢測(cè)動(dòng)物模型炎性反應(yīng)提供了有力依據(jù)。

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Establishment of Escherichia coli O127：H6 Infected Mouse Model and Expression of Regulated upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted

FAN Jun-wen1， SUI Li-hua1， XU Qin3， LIU Yi1， LIU Hui-fang1， SUN Zhao-zeng1， YAN Liang2
（1. Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100071， China；
2. Physical Examination Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China；
3. Department of Animal Experiment， Urumqi General Hospital，Lanzhou Military District， Urumqi 83000， China）

Objective To investigate the changes of jejunal pathology and expression of regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted （RANTES） in BALB/c mice infected with Escherichia coli O127∶H6. Methods Five groups of BALB/c mouse were administered intragastrically with different doses of Escherichia coli O127∶H6 and one group administered with saline as control. The jejunum of the mouse were embedded in paraffin， and pathological changes were observed by HE staining. The jejunal RANTES expression level in the all the mice were determined by using Real-Time PCR. Results The enteritis mice model was successfully established， and significant changes of jejunal inflammatory pathology were found in model groups compared with the control group. Real-Time PCR results showed that the expression level of jejunal RANTES in the model groups were significantly higher than that of control group. Conclusion Escherichia coli O127∶H6 can cause the changes of jejunum pathology in mice by intragastrical administration， and the RANTES expression level can be used as parameter to evaluate the in enteritis mice.

Escherichia coli O127∶H6； Pathological changes； Real-time fluorescence quantitalive PCR； regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted （RANTES）

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0001-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.001

2015-05-05

十二五重大專項(xiàng)（2011ZXJ09201-031）

范君文（1981-）， 男， 在讀博士， 助理研究員， 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型創(chuàng)制及病理學(xué)。E-mail: vetfjw@aliyun.com

閆 亮（1973-）， 男， 副主任醫(yī)師。E-mail: yliang3@tom.com