K+、Mn2+對番茄果實中番茄紅素積累及其關鍵酶基因表達的影響

王 艷，田紅梅，張 建，王明霞，賈 利，方 凌

（安徽省農業科學院園藝研究所 合肥 230031）

番茄是全球最重要的蔬菜之一，番茄紅素是決定番茄果實外觀顏色的最主要的物質，同時還是重要的功能性營養物質，是目前自然界中發現的最強抗氧化劑，可有效地減少單線態氧和氧自由基對人體自身免疫系統的侵害。番茄果實在低溫等條件下番茄紅素合成受阻導致轉色困難是生產上至今未攻克的難題。目前番茄紅素的生物合成途徑已基本清楚[1-2]，其中關鍵酶基因PSY和PDS已于1992年得到闡明[3-4]，對番茄植株生長過程中這2種基因表達的跟蹤研究表明，在番茄果實發育過程中，PSY表達量增加了20倍，PDS表達增加量則少于3倍[5]。果實中番茄紅素合成受諸多因素影響[6]。在前期的研究中，筆者初步探索了低溫條件對番茄紅素積累及其關鍵酶的影響[7]，本研究旨在前期研究的基礎上繼續探討外源物質（K+、Mn2+）對番茄紅素關鍵酶（PSY1、PSY2、PDS、ZDS）基因表達量的影響，為解決低溫條件下番茄轉色困難這一對生產造成嚴重影響的難題提供新的解決思路及途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為安徽省農業科學院園藝研究所培育的番茄高代穩定自交系‘T-CRH-13’。

1.2 方法

于2014年1月20日播種于安徽省農業科學院園藝研究所，穴盤育苗，3月22日定植，留3穗果打頂。從植株第一穗果果實膨大期開始，以清水為對照，澆施 240mg·L-1K2SO4（處理 1）、噴施0.1%MnSO4（處理2），每7 d處理1次，至果實膨大結束，采用隨機區組處理，每處理設3個小區，每小區12株，分5個時期采樣，根據果實成熟度標準在各小區隨機采樣，采樣標準：第1個時期為青熟期，果頂泛白；第2個時期為轉色期，果頂由白變紅；第3個時期為半熟期，果實一半轉色；第4個時期為堅熟期，整果著色，果實堅硬；第5個時期為完熟期，果實紅熟變軟（圖1）。每處理每小區取3～4果，將整果果肉（含果皮）打碎后混合取樣待測。

圖1 果實轉色的5個時期

采用分光光度計法和real-time實時熒光定量法測量果實轉色的各個時期果實內番茄紅素含量及PSY1、PSY2、PDS、ZDS的基因表達量。基因的相對定量分析采用ABI（Applied Biosystems）7500 Real Time PCR System進行，所用引物見表1，每個樣品3次技術重復。以Actin作為內參基因，采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量，數據采用Excel進行分析。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 K+處理后果實番茄紅素含量及合成途徑中關鍵酶的變化

2.1.1 K+處理后番茄紅素含量的動態變化 K+處理后果實中番茄紅素含量均隨果實成熟度增加而不斷增加，與對照的番茄紅素含量積累趨勢相似，且K+處理下的番茄紅素含量在果實發育的前2個時期積累緩慢，轉色期后積累迅速，在果實進入完熟期之前，其番茄紅素含量一直低于對照，至完熟期才明顯高于對照。對照與處理番茄紅素積累高峰期是一致的，均在轉色期至堅熟期（圖2）。

圖2 K+處理后果實不同成熟期番茄紅素含量的變化

2.1.2 K+處理后番茄紅素關鍵酶基因表達量的動態變化 如圖3所示，在完熟期之前，K+處理后果實不同成熟期的番茄紅素關鍵酶PSY1、PSY2以及ZDS基因表達量均低于對照，其中PDS基因表達量在堅熟期始高于對照，完熟期時PSY1、PSY2、ZDS以及PDS基因表達量均高于對照，這與K+處理后番茄紅素含量的積累規律是相似的，說明在果實完熟期之前K+可能通過某些作用抑制了這幾種酶的基因表達從而影響了果實中番茄紅素含量在這些階段的積累，使得番茄紅素含量低于對照，之后調控作用消失或者調控方向由負調控向正調控轉化，從而使得番茄紅素大量快速積累，至完熟期明顯高于對照。

圖3 K+處理后果實不同成熟期番茄紅素關鍵酶基因表達量的動態變化

2.2 Mn2+處理后果實中番茄紅素含量及其關鍵酶的動態監測

2.2.1 Mn2+處理后果實中番茄紅素含量的動態變化

圖4 Mn2+處理后果實不同成熟期番茄紅素含量的變化

由圖4可以看出，Mn2+處理后果實不同成熟期的番茄紅素含量在整個果實轉色過程中雖然是一直上升的，但均低于對照水平，這與有些文獻中報道的試驗結果不一致。對照條件下，番茄紅素迅速積累及在轉色期至堅熟期，而Mn2+處理下的番茄果實中番茄紅素含量快速積累期在堅熟期至完熟期，這說明在本試驗中，Mn2+處理后番茄紅素積累的高峰期延遲，并且降低了番茄紅素含量的整體水平。

2.2.2 Mn2+處理后果實的番茄紅素關鍵酶基因表達量的動態變化 從圖5可以看出，Mn2+處理后果實不同成熟期的各番茄紅素關鍵酶基因表達量的變化規律不同。其中PSY2隨轉色程度的加深而逐漸升高，PSY1從青熟期至轉色期有較大幅度的升高，之后有所下降，在半熟期后逐漸升高，轉色期與完熟期2個時期的PSY1基因表達量差異不明顯，Mn2+處理后的番茄果實其完熟期PSY1、PSY2的基因表達量均高于對照水平；而Mn2+處理后番茄果實中的PDS、ZDS基因表達量水平在5個轉色時期均明顯低于對照水平，這可能是造成其番茄紅素含量低于對照水平的主要原因。

圖5 Mn2+處理后果實不同成熟期番茄紅素關鍵酶基因表達量的動態變化

3 討論與結論

前人研究表明，K+與Mn2+處理可使果實中的番茄紅素含量增加[8-10]。本試驗發現，K+在調控果實中番茄紅含量積累上起到了一定的作用，且在不同發育時期調控效果是不同的，在果實轉色的前4個時期，番茄紅素含量一直低于對照，即在轉色前幾個階段，K+對番茄果實中番茄紅素的積累并未起到促進作用，堅熟期至完熟期，正向調控作用才充分發揮出來，在番茄果實不同的轉色階段，K+發揮的調控作用是不同的，堅熟期之前是抑制了八氫番茄紅素向番茄紅素轉化過程中PSY1、PSY2、ZDS以及PDS這些關鍵酶基因的表達而使得番茄紅素含量減少，堅熟期之后這些關鍵酶基因的表達量有了快速的升高，從而番茄紅素也大量積累，明顯高于對照，這也說明了K+不僅參與了整個番茄紅素合成途徑的八氫番茄紅素脫氫過程，而且參與了從八氫番茄紅素合成六氫番茄紅素，再脫飽和至ζ-胡蘿卜素、鏈孢紅素的過程中（圖 6）[11-12]。

圖6 番茄紅素合成途徑圖

GGPS活性依賴PSY，Mn2+是決定GGPS用來合成類胡蘿卜素還是其他類異戊二烯產物的關鍵調控因子，對番茄紅素的合成至關重要。PSY是控制番茄紅素合成的一個限速酶基因，控制著GGPP向八氫番茄紅素的轉化，PSY催化八氫番茄紅素的形成依賴Mn2+[13]。本研究發現，Mn2+處理后的PSY基因表達量并不是在果實轉色的每個時期都高于對照，而是在堅熟期后至完熟期高于對照，而其他2個酶PDS、ZDS基因表達量則一直低于對照，從而使番茄紅素積累至完熟期仍低于對照，這與前人的研究中適宜濃度的錳肥葉面噴施可以提高番茄果實中的番茄紅素含量的結論相異。

果實發育堅熟期至完熟期可通過K+調控而使該階段的番茄紅素含量迅速積累，在果實發育的不同階段，K+所表現出的對番茄紅素積累的不同調控方向，說明K+在番茄紅素合成的過程中所起到的作用可能不僅僅是調控PSY1、PSY2、ZDS以及PDS這些酶，深入的調控機制有待進一步的試驗探索；不同番茄材料對Mn2+的調控響應存在差異，是否與材料的基因型差異有關還需要進一步探索。