尿激酶對大鼠肺成纖維細胞凋亡的影響*

邵景韞　劉 　安　杜旭升　郭　華　陳明偉

西安市中心醫院呼吸科(西安710003)

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尿激酶對大鼠肺成纖維細胞凋亡的影響*

邵景韞劉 安杜旭升郭華陳明偉▲

西安市中心醫院呼吸科(西安710003)

目的：探討尿激酶(Urokinase，UK)對大鼠肺成纖維細胞凋亡的影響。方法：5只SD雄性大鼠氣管內灌注博萊霉素造肺纖維化模型，將模型組肺成纖維細胞與不同濃度的尿激酶培養24～96h，流式細胞術測定細胞凋亡。結果：尿激酶以時間和濃度依賴的方式抑制肺成纖維細胞生長，流式細胞術檢測到凋亡小體。結論：尿激酶能抑制肺成纖維細胞增殖，與凋亡有關。

主題詞成纖維細胞/藥物作用肺細胞凋亡博萊霉素/化學誘導尿激酶/治療應用模型，動物大鼠

肺纖維化發病隱匿、進展迅速、病死率高，近年來，發病呈上升趨勢，嚴重影響患者生存質量及預后的慢性肺部疾患[1]，其發病機制不明確，無有效治療手段。臨床上應用尿激酶防治炎性胸膜炎形成的胸膜粘連、肥厚的治療，但肺纖維化方面的研究很少。本研究通過尿激酶對大鼠肺成纖維細胞凋亡的影響，探討肺纖維化的發生機制。

材料與方法

1材料與儀器注射用鹽酸博萊霉素粉劑購于日本化藥株式會社，用生理鹽水配成5g/ L；尿激酶粉針劑購于天津生物化學制藥有限公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購于南京凱基生物；Vimentin(種屬：小鼠)購于武漢博士德生物工程有限公司；Cy3標記羊抗小鼠IgG購于武漢博士德生物工程有限公司；Triton×100、DAPI購于碧云天生物技術公司；FACSCalibur流式細胞儀購于美國B-D公司。

2實驗方法

2.1制備大鼠肺纖維化模型：模型組取清潔級雄性SD大鼠5只購于第四軍醫大學動物實驗中心，平均體重220.5±14.5g，采用Mitsuhashi H方法，氯胺酮按大鼠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，無菌下行頸正中切口，逐層分離暴露氣管，氣管插管注入0.3～0.5ml(5mg/kg)博萊霉素[2]，立即翻轉動物藥物在肺內均勻分布，繼續飼養。

2.2肺成纖維細胞的分離、培養、純化與鑒定：取模型組大鼠5只，平均體重220.5±14.5g，處死大鼠，無菌剝離大鼠肺臟，培養大鼠肺成纖維細胞，對第四代細胞進行細胞鑒定，一抗為小鼠Vimentin，二抗為Cy3標記羊抗小鼠IgG對大鼠肺成纖維細胞進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下鑒定肺成纖維細胞。

2.3MTT法觀察尿激酶對肺成纖維細胞增生的作用：取3～5代大鼠肺成纖維細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化，分別收集計數并調整細胞密度為4×107/L，接種于96孔培養板，每孔100μl，同時設空白對照組，為200μl無菌PBS，37℃，5%CO2條件下培養，加入5、10、20、30×106U/L含尿激酶的培養基，設10個復孔，分別培養24，48，72，96h，每孔再加入含MTT的DMEM培養基100μl，繼續培養4h，吸出孔內液體，加入150μlDMSO，酶標儀OD568nm測定各孔吸光值，繪制細胞生長曲線，以時間為橫軸，OD值為縱軸。

2.4觀察尿激酶對大鼠肺成纖維細胞的凋亡：流式細胞儀結合PI及Annexin V-FITC雙標記染色測定細胞凋亡：取3～5代大鼠肺成纖維細胞，分別加入5、10、20、30×106U/LUK后培養24h，經胰蛋白酶消化后移入離心管，洗滌、離心，棄上清，加入buffer溶液，吹打致密度為4×108/L，取100μl，暗處加入Annexin V和PI各5μl，振蕩混勻，室溫避光30min上樣，用流式細胞儀分析凋亡率。

結　果

1肺FB鑒定結果肺FB經7～10d培養后鋪滿瓶底，細胞為梭形，呈放射狀或柵欄狀排列，加入Vimentin一抗及熒光二抗后，從加熒光二抗起，所有操作都在較暗處進行。滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，熒光染色細胞核DAPI染色藍色，細胞漿波形蛋白陽性表達，即紅色(見圖1)。

2UK對大鼠肺FB增殖抑制作用加入5、10、20、30×106U/L的UK24h后的OD 568nm較對照組顯著降低(P<0.05)，提示UK以時間和劑量依賴方式抑制大鼠成纖維細胞增殖(見圖2)。

圖1　大鼠肺成纖維細胞波形蛋白免疫熒光染色(×400)

圖2尿激酶對大鼠肺成纖維細胞生長曲線[系列1～5：對照組、5×106U/L，10×106U/L，20×106U/L，30×106U/L尿激酶]

3UK對大鼠肺成纖維細胞凋亡的作用流式細胞儀結合PI及Annexin V-FITC雙標記染色檢測示尿激酶作用大鼠肺成纖維細胞后，可見明顯凋亡小體或凋亡細胞。

討　論

肺纖維化是由多種病因引起的慢性肺泡間質性炎癥，肺泡結構進行性損害，細胞外基質及膠原沉積為特征的疾病。肺纖維化晚期為肺間質纖維化和蜂窩肺[3]。肺成纖維細胞是肺纖維化發生、發展過程中起關鍵作用的細胞，肺纖維化發病可能與成纖維細胞過度增殖、不能及時凋亡有關[4]，成纖維細胞凋亡減少可能導致持續的修復過程失調引發纖維化[5]。

尿激酶在體外能抑制細胞外基質中膠原合成，起到抗纖維化的作用。UPA參與血管新生，基質重構、ECM降解，與肺纖維化密切相關[6]。肺纖維化時UPA與PAI-1表達失衡，UPA下降，其抑制劑PAI-1增加，增加UPA可減降低肺纖維化程度。

本研究中鑒定成纖維細胞免疫熒光實驗，細胞漿波形蛋白陽性表達(即紅色)，證實為成纖維細胞。本研究發現：MTT比色法觀察到UK對肺纖維化大鼠肺成纖維細胞作用24～96h，不同濃度尿激酶組OD568nm值均低于對照組，顯示UK以時間和劑量依賴方式抑制細胞增殖；流式細胞儀結合PI及AnnexinV-FITC雙標記染色檢測可見B2、B4區可見凋亡細胞，證明UK抑制大鼠肺成纖維細胞增殖與細胞凋亡有關。

實驗表明：尿激酶抑制大鼠肺成纖維細胞增殖通過誘導成纖維細胞凋亡發生。促進肺損傷過程中成纖維細胞的及時凋亡有望成為治療肺纖維化的有力措施。

[1]Jordan RC,Erin EM.Recent evidence for pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Annals of Pharmacotherapy，2014，48(12)：1611-1619.

[2]劉延梅,馬少君,苗 青,等.川穹嗪聯合胚胎干細胞治療大鼠肺纖維化的機制研究[J].陜西醫學雜志,2014,43(1):10-14.

[3]Noble PW,Barkauskas CE,Jiang D.Pulmonary fibrosis ：patterns and perpetrators[J].J Clin Invest, 2012,122(8):2756-2762.

[4]Nho RS,Peterson M,Hergert P,etal.FoxO3a (Forkhead Box O3a) deficiency protects idiopathic pulmonary fibrosis(IPF) fibroblasts from type I polymerized collagen matrix-induced apoptosis via caveolin-1 (cav-1) and fas[J]. PLoS One，2013,8(4):e61017.

[5]張效云,李琦.細胞自噬與肺纖維化[J].生理科學進展,2015,46(4):314-316.

[6]張紓難,賈明月,于 洋.近5年中醫呼吸病學術發展述評[J].世界中醫藥，2014，9(8)：969-973.

(收稿：2016-03-20)

Effect of urokinase on apoptosis of pulmonary fibroblasts in rats

Department of Respiratory Medicine,Xi’an Central Hospital (Xi’an710003)

Shao JingyunLiuAnDu Xushenget al

Objective: To study the effect of urokinase on apoptosis of pulmonary fibroblasts in rats.Methods:Five SD male rats were modeled pulmonary fibrosis modelling by endotracheal perfusion bleomycin.Pulmonary fibroblasts in the model group were cultured with urokinase of different concentrations for 24～96 hours. Cell apoptosis was examined by flow cytometry.Results:Urokinase inhibited pulmonary fibroblasts in time and concentration dependent manners.Apoptosis bodies were found by flow cytometry.Conclusion: Urokinase can inhibit the proliferation of fibroblast，which isrelated to cell apoptosis.

Fibroblasts/drug effectiveLungApoptosisBleomycin/ chemically inducedUrokinase/therapeutic useModel,animalRats

西安交通大學第一附屬醫院呼吸科

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.002

*陜西省科技研究發展計劃(2014KCT-23)

陜西省西安市科技計劃項目[SF1316(1)]