痛寧凝膠臨床研究模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍的含量測定△

王星星，劉莉莉，吳云，于丹，王振中，蕭偉*

(1.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222067；2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222067)

痛寧凝膠臨床研究模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍的含量測定△

王星星1，2，劉莉莉1，2，吳云1，2，于丹1，2，王振中1，2，蕭偉1，2*

(1.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222067；2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222067)

目的：建立紫外分光光度法對痛寧凝膠臨床研究模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍3種色素的含量測定方法，用于監控模擬劑的質量及穩定性。方法：應用紫外分光光度法測定檸檬黃、誘惑紅和亮藍在痛寧凝膠臨床研究模擬劑中的含量，確定色素的最大吸收波長及最大吸收波長處的吸收系數和摩爾吸收系數，并測定樣品中色素的含量。結果：檸檬黃在426 nm處的a=41.2 L·g-1·cm-1，ε=2.201 3×104mol·L-1·cm-1；誘惑紅在503 nm處的а=45.5 L·g-1·cm-1，ε=2.225 6×104mol·L-1·cm-1；亮藍在629 nm處的а=141.3 L·g-1·cm-1，ε=1.207 1×105mol·L-1·cm-1；在(40±2)℃、RH 65%±5%條件下，亮藍的含量未發生變化，檸檬黃和誘惑紅的含量明顯下降。在(25±2)℃、RH 60%±10%條件下，3種色素含量穩定無變化。結論：建立的紫外分光光度法能夠準確地測定模擬劑中色素的含量；通過紫外分光光度法的測定，模擬劑在高溫高濕[(40±2)℃、RH 65%±5%]條件下不穩定，色素含量下降，在常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]條件下色素含量無變化，穩定性好，此方法可以較好地監控模擬劑的質量及穩定性。

紫外分光光度法；檸檬黃；誘惑紅；亮藍；穩定性

檸檬黃、誘惑紅、亮藍作為我國允許使用的食用合成色素，其規定最大用量為0.1 g·Kg-1。合成色素常采用比值導數波譜法[1]、主成分回歸光度法[2]、示波極譜法[3-4]、因子分析-光度法[5]、高效液相色譜法[6-7]、多波長線性回歸-導數分光光度法[8-9]、多元線性回歸K系數法[10-11]、薄層色譜掃描分析法[12]、計算機差譜法[13]、毛細管電泳法[14-15]、導數吸附伏安法[16]、固定PH值滴定法[17]、高聚物萃取分光光度法[18]、三維熒光光譜結合平行因子算法[19]等進行測定。對于兩組分及以上人工合成色素多采用紫外分光光度法[20]、雙波長K系數法[21]等進行同時測定。

痛寧凝膠臨床研究模擬劑(安慰劑)主要用于突顯痛寧凝膠藥物的臨床療效，其由卡波姆加水溶脹，與檸檬黃、誘惑紅、亮藍3種色素配制而成，色素的使用量符合國家規定。由文獻報道[22]得出，檸檬黃和誘惑紅在高溫高濕條件下不穩定。本文將研究建立檸檬黃、誘惑紅和亮藍3種色素的含量測定方法，以考察和控制模擬劑的質量，為監控樣品穩定性提供有效的評價方法。紫外分光光度法雖然不是最先進的檢測方法，但它多用于食品工業的色素測定，本研究旨在將其用于藥品色素的檢測中，為藥品的色素檢測提供一種方法。

1 儀器和試劑

UV-2450 紫外可見分光光度計(島津)；聚酰胺樹脂(浙江永在化工有限公司)；檸檬黃、誘惑紅、亮藍[浙江吉高德色素科技有限公司(中意合資)]；檸檬酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；甲醇-甲酸(3∶2)、乙醇-氨水-水混合溶液(7∶2∶1)、冰乙酸(南京化學試劑有限公司)；實驗用水均為一次蒸餾水。

2 實驗部分

2.1 實驗原理

當3種吸光物質的吸收光譜兩兩互相重疊，且其最大吸收互有干擾時，可依據吸光度的加和性，通過解聯立方程組來進行測定[23-25]。設試樣中有A、B、C 3種吸光組分，根據其吸收光譜，確定A、B、C 3種組分的最大吸收波長λ1、λ2和λ3，然后分別測定3種組分在λ1、λ2和λ3處的吸收系數，再分別測量三組分在波長為λ1、λ2和λ3處的吸光度值，設為Aλ1和Aλ2，Aλ3，解聯立方程：

(1)

(2)

(3)

(4)

ε=α·M

(5)

其中，α為吸收系數，M為色素的摩爾質量。

2.2方法與結果

2.2.1 模擬劑的制備 卡波姆加水溶脹，色素加適量水溶解制成溶液，緩慢加入溶脹后的卡波姆中，攪拌均勻后灌裝，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別準確稱取檸檬黃、誘惑紅和亮藍0.100 0 g，用pH≈6的蒸餾水分別溶解定容100 mL，配成質量濃度為1 g·L-1的儲備液。稀釋成0.1 g·L-1的對照品溶液，此溶液每1.0 mL相當于0.1 mg的商品合成色素。

2.2.3 吸收光譜的測定 分別準確吸取0.5 mL檸檬黃、誘惑紅和亮藍色素對照品溶液，置于10 mL比色管中，蒸餾水稀釋至刻度。在UV-2450全波長紫外可見分光光度計上選擇重疊掃描方式，在330～700 nm掃描3種色素的吸收光譜，確定最大吸收波長。見圖1。

注：1.檸檬黃；2.誘惑紅；3.亮藍。圖1 檸檬黃、誘惑紅和亮藍的吸收光譜

結果表明，檸檬黃在330～520 nm處有明顯吸收，最大吸收波長為λmax=426 nm；誘惑紅在430～580 nm處有明顯吸收，最大吸收波長為λmax=503 nm；亮藍在580～670 nm處有明顯吸收，最大吸收波長為λmax=629 nm。

2.2.4 檸檬黃、誘惑紅、亮藍在不同波長下吸收系數的測定 依據2.2.3，在波長426、503、629 nm處分別測定檸檬黃、誘惑紅和亮藍的吸光度，由式(4)、(5)計算出檸檬黃、誘惑紅和亮藍的吸收系數а及摩爾吸收系數ε，結果見表1～3。

表1 檸檬黃色素在不同波長處的ε值

表2 誘惑紅色素在不同波長處的ε值

表3 亮藍色素在不同波長處的ε值

2.2.5 檸檬黃、誘惑紅和亮藍標準曲線的測定 分別準確吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL檸檬黃和誘惑紅色素對照品溶液，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL亮藍色素對照品溶液，置于10 mL比色管中，蒸餾水稀釋至刻度。UV-2450全波長紫外可見分光光度計，1 cm比色皿，蒸餾水為參比，分別在426、503、629 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。計算得到方程，檸檬黃：Y=41.52X-0.003，r=0.999 0；誘惑紅：Y=45.73X+0.009，r=0.999 0；亮藍：Y=141.3X+0.175，r=0.994 0，其斜率即為待測組分的吸收系數。結果表明，實驗值與所述計算值基本相符，證明此方法可行。

2.3 模擬劑中色素含量的測定

2.3.1 供試品溶液的制備 稱取制備好的模擬劑5 g，放入100 mL燒杯中，加入50%乙醇溶液30 mL，溫熱溶解，加熱至60 ℃。將1 g聚酰胺粉加少許水調成糊狀，倒入試樣溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃、pH值為4的水(檸檬酸水)洗滌3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液(3∶2)洗滌3～5次，再用蒸餾水洗至中性。用乙醇-氨水-水混合溶液(7∶2∶1)解吸3～5次，每次5 mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解，定容至5 mL。

2.3.2 空白樣品吸收光譜的測定 卡波姆加水溶脹制得空白樣品，按照2.3.1方法處理得供試品溶液，測定吸光度。結果表明，空白樣品在426、503、629 nm處均無吸收，排除了卡波姆的干擾。

2.3.3 模擬劑吸光度的測定 利用紫外分光光度計分別在426、503、629 nm處測定模擬劑的吸光度值，解聯立方程(1)、(2)、(3)，計算模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍的濃度，結果見表4。

表4 模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍的含量

2.3.4 回收率的測定 在模擬劑50%乙醇溶液中分別加入0.126 μg·mL-1的檸檬黃、0.079 μg·mL-1的誘惑紅和0.01 μg·mL-1的亮藍對照品溶液1 mL，每個加標水平重復6次。利用2.3.1的方法處理樣品，分別在426、503、629 nm處測定樣品的吸光度值，解聯立方程(1)、(2)、(3)，計算樣品中檸檬黃、誘惑紅和亮藍的濃度及回收率。結果見表5～7。

由表5～7得出，檸檬黃、誘惑紅和亮藍的回收率分別為96.8～100.0、97.2～100.2、98.2～100.3，均在合格范圍內。

2.3.5 影響因素實驗 高溫高濕實驗：將制備好的模擬劑放入加速箱內[(40±2)℃、RH 65%±5%]及常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]，分別于0、3、6、8、10 d觀察其形態及顏色的變化，并測定色素的含量。色素的分離及吸光度的測定同2.3.1和2.3.3。結果見表8～9。

表5 檸檬黃的回收率

表6 誘惑紅的回收率

表7 亮藍的回收率

表8 模擬劑在高溫高濕條件下的測定結果

注：1.顏色依據工業國際標準色卡對照表；2 d樣品的顏色為8003土棕褐色。

表9 模擬劑在常溫條件下的測定結果

由表8得出，模擬劑在(40±2)℃、RH 65%±5%的條件下，放置時間≥6 d時，形態無變化，但顏色發生了改變，模擬劑中的檸檬黃和誘惑紅兩種色素的濃度明顯降低，RSD值分別為47.8%和58.9%，因此濕度是導致樣品顏色發生改變的原因。此實驗證明，檸檬黃和誘惑紅兩種色素在此條件下不穩定。因此我們要降低貯藏溫濕度為(25±2)℃、RH 60%±10%。由表9得出，模擬劑在(25±2)℃、RH 60%±10%的條件下，形態和顏色均無變化，穩定性好。

強光照射實驗：制備好的模擬劑于照度為(45 001±5001)x條件下放置10 d，保持室溫為(25±2)℃、RH 60%±10%，分別于0、5、10 d取樣檢測，色素的分離及吸光度的測定同2.3.1和2.3.3。結果見表10。

表10 模擬劑在強光照射條件下的測定結果

由表10得出，模擬劑在強光照射10 d后，形態和顏色均無變化，穩定性好。

2.3.6 18個月穩定性試驗 制備好的3批模擬劑，常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]放置，分別于0、1、2、3、6、9、12、18個月取樣，觀察性狀及顏色的變化，并測定色素的含量。結果見表11。

由表11可以看出，0～18個月，樣品的形態和顏色均無變化，同時紫外分光光度法檢測數據也未發生明顯改變。因此，模擬劑可以在常溫[(25±2)℃、RH 60%±10%]的條件下貯藏，質量基本穩定。

表11 18個月穩定性的測定結果

3 結論

研究擬定的紫外分光光度法同時測定模擬劑中檸檬黃、誘惑紅和亮藍的檢測方法，可以靈敏的檢測出模擬劑中色素的含量，該方法準確度高、靈敏度好、重現性強，可用于模擬劑的質量及穩定性的監控。

4 討論

我們考察了模擬劑在高溫高濕、光照影響因素條件下的形態和顏色變化，在(40±2)℃、RH 65%±5%條件下模擬劑的顏色和濃度均發生變化，故又考察了溫濕度(25±2)℃、RH 60%±10%對模擬劑18個月穩定性的影響，以確定樣品的貯藏條件。

檸檬黃和誘惑紅在高溫高濕條件下不穩定，提示此類色素在模擬劑制備過程中需要嚴格控制產品的貯藏條件。應用紫外分光光度法檢測可以準確反應樣品中色素含量的變化，且變化規律與樣品實際顏色發生改變存在明顯正相關系，說明檢測的靈敏度明顯優于肉眼觀察，可以更加準確地監控產品質量。

本研究也提示，模擬劑的貯藏條件是不應忽視的問題。消除不穩定因素，才能確保模擬劑在臨床使用過程中的質量穩定，進而保證樣品的穩定、均一及安全。

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ContentsDeterminationofLemonYellow，FancyRedandBrightBlueinClinicalPlaceboofTongningGel

WANG Xingxing1，2，LIULili1，2，WUYun1，2，YUDan1，2，WANGZhenzhong1，2，XIAOWei1，2*

(1.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.Ltd.JiangsuLianyungang222067，China；2.StateKeyLaboratoryofNew-TechforChineseMedicinePharmaceuticalProcess，JiangsuLianyungang222067China)

Objective：To establish a quantitative method of three pigments lemon yellow，fance red and bright blue for quality control of the placebo.Method：The pigments were determined by UV spectrophotometry，and the maximum absorption and absorption coefficient and molar absorption coefficient of the pigments were determined，and their contents o in clinical placebo of Tongning gel were thereafter quantified.Result：The results were follows：lemon yellow：α=41.2 L·g-1·cm-1，ε=2.201 3×104 mol·L-1·cm-1on 426 nm，fancy red：α=45.5 L·g-1·cm-1，ε=2.225 6×104 mol·L-1·cm-1on 503 nm，and bright blue：α=141.3 L·g-1·cm-1，ε=1.207 1×105 mol·L-1·cm-1on 629 nm；The concentration of bright blue was unchanged，but lemon yellow and fancy red were unstable.Conclusion：The established UV spectrophotometry method is suitable for determination the pigments in placebo of Tongning gel at room temperature and destructive test.It can accurately control quality and stability of the placebo.

UV spectrophotometry；lemon yellow；fancy red；bright blue；stability

2014-11-26)

重大新藥創制(2013ZX09402203)

*

蕭偉，博士，研究員級高級工程師，研究方向：中藥新藥的開發與研究；Tel：(0518)81152367，Email：kanionlunwen@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.024