廣西莪術葉斑病病原鑒定及生物學特性研究△

蔣妮，劉麗輝，胡鳳云，劉威，劉凡

(廣西藥用植物園,廣西 南寧 530023)

廣西莪術葉斑病病原鑒定及生物學特性研究△

蔣妮*，劉麗輝，胡鳳云，劉威，劉凡

(廣西藥用植物園,廣西 南寧 530023)

目的：明確廣西莪術葉斑病病原菌種類，掌握其生物學特性。方法：依據柯赫氏法則進行致病性測定和病原菌驗證，通過形態學特征觀察、rDNA-ITS序列分析來確定病原菌；設置不同的培養基、溫度、PH值、濕度，觀測菌絲生長及孢子萌發，進行生物學特性研究。結果：病原菌為大豆擬莖點種腐病菌(Phomopsis longicolla)；菌株在PDA培養基生長良好，加了莪術汁的PDA培養基更利于生長及產孢，溫度20～30 ℃、PH值5～6條件下適宜菌絲生長及孢子萌發，RH為80%時孢子萌發率最高。結論：廣西莪術葉斑病病原菌鑒定為Phomopsislongicolla；中溫、潮濕、偏弱酸性環境條件適宜該菌生長。

廣西莪術；病害；病原鑒定；生物學特性

廣西莪術CurcumakwangsiensisS.G.Leset C.F.Liang，為姜科姜黃屬多年生草本植物，是中藥莪術的三大基源植物之一，又稱桂莪術、毛莪術。以根莖作為中藥莪術使用，具有破瘀行氣、消積止痛之功效；塊根作為中藥郁金(習稱“桂郁金”)使用，有行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃的功能；近期文獻報道莪術油還具有抗腫瘤、抗病毒等作用[1-2]。廣西作為廣西莪術的道地藥材產區，傳統種植于欽州靈山縣、貴港市等地，南寧市隆安縣也有栽培，全區種植面積上萬畝。近年來隨著藥材及其他作物種植結構的調整，以及周邊環境的不斷變化，廣西莪術葉斑病發生嚴重。病害發生早期多從葉尖或葉緣處出現黃褐色斑點，隨著病原菌的不斷侵染，病斑逐漸向葉中脈擴展，引起葉片大面積枯黃，后期植株早衰死亡，嚴重影響廣西莪術的栽培生產。國內外關于廣西莪術病害的研究尚未見報道，葉斑病為廣西莪術病害的首次報道。因此，明確廣西莪術葉斑病病原菌種類及其生物學特性，能夠對該病害的預防與控制提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 采樣與分離

2013年6月，在廣西隆安縣城廂鎮小林村廣西莪術種植基地，采集具有典型癥狀的莪術病葉及健康葉片，用清水洗凈病葉表面，進行病原菌的分離及純化[3]：在病健交界處剪取20塊長寬4～5 mm的病葉組織，用75%的酒精消毒2～3 s，0.1%升汞消毒2 min，無菌水沖洗3遍，置于滅菌濾紙上，吸干水后將病葉組織分別接到裝有PDA培養基的培養皿上，共20 皿，在26 ℃恒溫條件下培養，4天后挑取組織塊周圍的菌絲轉皿培養、純化，對分離物歸類、編號、轉管保存。

1.2 致病性測定

采取針刺方式進行。將純化的菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，在28℃、RH為65%霉菌培養箱內擴繁培養5 d，用打孔器制成直徑為9 mm的菌片備用。用無菌接種針在健康的廣西莪術葉片上刺成面積約為1 cm2的傷口，用接種鏟將菌片接至傷口，保濕培養3～4 d，觀察發病情況。根據柯赫氏法則，對發病葉片進行再分離，顯微鏡下觀察分離病菌與原接種菌株是否相同[3]。以接種PDA培養基作為對照，在室溫(20 ℃～25 ℃)下保濕培養5天，記錄發病情況。

1.3 形態學鑒定

將分離純化后的病原菌在PDA上培養5 d，在菌落邊緣取菌絲塊接種于無菌廣西莪術葉片，在25 ℃、12 h/12 h光照/黑暗交替條件下培養，20 d后，在光學顯微鏡下進行病原菌形態學觀察和測量，包括子座大小、分生孢子器形態及排列、分生孢子形態及大小等。

1.4 核糖體rDNA-ITS序列分析

采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA[4]。采用真菌核糖體基因轉錄間隔區(ITS)通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)和ITS5(5′ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′)(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，擴增該菌的rDNA-ITS序列。擴增產物的純化和序列測定委托北京諾賽生物科技有限公司進行，所得到的核苷酸序列與GenBank中相關菌株進行同源性比較[5]。

1.5 不同培養基對菌絲生長的影響

選用5種培養基(編號1號～5號)觀察菌絲生長情況：1號PDA培養基(1000 mL清水+200 g馬鈴薯+20 g蔗糖+20 g瓊脂)、2號PDA莪術汁培養基(1000 m1清水+200 g馬鈴薯+10 g莪術汁+20 g蔗糖+20 g瓊脂、)、3號燕麥培養基(清水l000 mL+30 g燕麥+25 g瓊脂)、4號燕麥馬鈴薯培養基(1000 mL清水+200 g馬鈴薯+30 g燕麥+20 g瓊脂+20 g蔗糖)、5號玉米培養基(清水1000 mL+50 g玉米粉+10 g瓊脂)，清水瓊脂培養基做對照。在病原菌菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅移植到上述培養基，25 ℃恒溫培養，培養72 h、96 h、120 h時分別采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算平均值。每個處理重復3次。

1.6 不同溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響

將直徑為5 mm的病原菌菌餅移植到PDA莪術汁培養基平板上，在5、10、15、20、25、30、35 ℃ 7個不同溫度條件下培養，120 h后測量菌落直徑，每個處理重復3次。以pH為6的1%莪術葉片汁配制孢子懸浮液(15×40倍視野鏡下20～25個孢子)，滴于凹玻片上，分別放置于10、15、20、25、30、35、40 ℃下進行培養，48h后觀察其萌發率，每處理重復3次。

1.7 PH值對菌絲生長和孢子萌發的影響

用滅菌的NaOH和HCl分別調節莪術汁PDA培養基pH值至2、3、4、5、6、7、8、9，并制成平板，接入5 mm的病原菌菌餅，25 ℃恒溫培養，接種后120h測量菌落直徑，每處理重復3次。配置1%莪術葉片汁孢子液(15×40倍視野鏡下20～25個孢子)，以滅菌的NaOH和HCl調節上述培養基pH值為l、2、3、4、5、6，7、8、9、10、1l的梯度。將孢子液滴于凹玻片上，25 ℃恒溫培養，48 h后觀察其萌發率。每處理重復3次。

1.8 濕度對孢子萌發的影響

在干燥器內用不同濃度的硫酸將干燥器分別調制成相對濕度為90、80、70、60、50、20、10%的梯度濕度，將1%莪術葉片汁孢子懸浮液(15×40倍視野鏡下20～25個孢子)滴于凹玻片上，分別放置于上述各相對濕度的干燥器中，25 ℃恒溫培養，48 h后觀察孢子萌發率，每處理重復3次。

2 結果和分析

2.1 病害癥狀

發病植株的癥狀主要表現在葉片，病原菌主要侵染植株的中上部葉片，一般先侵染嫩葉。病害發生早期多從葉尖或葉緣處開始出現淡黃色的水漬狀斑點，病健交界明顯，隨著病原菌的不斷侵染，病斑逐漸向葉中脈擴展，形成邊緣褐色、中間暗褐色并凹陷的“V”形大病斑，病斑上可見黑色小顆粒(分生孢子器)，后期葉片枯黃、植株死亡。

2.2 病原菌分離、純化及致病性測定

將病組織置于PDA平板，25 ℃恒溫培養3～4 d后，所有病組織均長出菌落，對各菌落進行編號、純化，其中產孢真菌用單孢分離法對進行純化，不產孢真菌采用多次挑取菌落邊緣菌絲轉皿純化，共得到22個純化菌株。在室內將所有菌株離體接種至健康的廣西莪術葉片，保濕培養5 d后，僅編號為v-3菌株接種后發病，對照未發病。發病葉片表現出明顯的黃褐色病斑，對發病葉片進行再分離，獲得與原分離菌株一致的病原菌。根據柯赫氏法則，V-3菌株為該病的致病菌株。

2.3 病原菌的形態特征

菌株V-3在PDA培養基上生長良好，菌落圓形，菌絲白色、有隔，疏松絨毛狀，2周后培養基背面產生黑色球形至不規則形分生孢子器，直徑200～500 μm，但挑取分生孢子器在顯微鏡下難觀察到分生孢子。接種病原菌的莪術葉片，培養15 d后可產生分生孢子器；在顯微鏡下可觀察到兩種類型分生孢子，其中α型分生孢子長紡錘形，無色，單孢，含有l-2個油球，大小為(5.2～28.2)μm×(1.5～7.1)μm；β型分生孢子無色，線形，一端稍彎曲，單孢，l-3個油球，大小為(2.5～12.2)μm×(1.0～3.1)μm。根據上述形態特征，認為該病原菌為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)真菌。

2.4 病原菌核糖體DNA-ITS序列分析

采用通用引物ITS1/ITS4對V-3菌株的rDNA—ITS序列進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1個大小約為500 bp的片段，經序列測定，確定該片段全長451 bp，1～51 bp為部分18SrDNA，52～01 bp為ITS1，202～351 bp為5.8SrDNA，352～401 bp為ITS4，402～451 bp為部分5.8SrDNA(圖1)。將上述測序結果在GenBank中進行同源性分析，該病原菌株與(Phomopsissp.)同源性達99%。結合形態鑒定確定該病原菌為擬莖點霉屬真菌(Phomopsissp.)。

ACCTGCGGAGGGATCATTGCTGGAACGCGCTTCGGCGCACCCAGAAACCCTTTGTGAACTTATACCTATTGTTGCCTCGGCGCAGGCCGGCCTCTTCACTGAGGCCCCCTGGAGACAGGGAGCAGCCCGCCGGCGGCCAACCAAACTCTTGTTTCTACAGTGAATCTCTGAGTACAAAACATAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCACTGCTCTCTGACGGGAGCAGGCCCTGAAATCTAGTGGCGAGCTCGCTAGGACCCCGAGCGTAGTAGTTATATCTCGTTCTGGAAGGCCCTGGCGGTGCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAAAATTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

圖1病原菌ITS-rDNA片段序列圖

2.5 培養基對菌絲生長的影響

試驗結果(圖2)表明，菌絲在PDA培養基(1號)、莪術汁PDA培養基(2號)燕麥馬鈴薯培養基(4號)上生長120h后，菌落平均直徑分別為80.5mm、88.5mm、75.8mm，顯著大于其他培養基，其中2號培養基菌株生長最旺盛，菌絲呈白色絮狀且較1號培養基的菌絲稍致密，菌落突起。5號玉米培養基上菌絲生長最差。

圖2 不同培養基對菌絲生長的影響

2.6溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響

圖3-a顯示：該菌絲生長溫度范圍為10 ℃～35 ℃，最適宜溫度范圍為20 ℃～30 ℃，以25 ℃條件下菌絲生長最好，平均直徑為62.0mm，顯著大于其他溫度條件下培養的菌落直徑，在5 ℃、40 ℃下不能生長。圖3-b顯示：分生孢子在10 ℃～35 ℃范圍內均能萌發，20 ℃～30 ℃適宜孢子萌發，其中25 ℃條件下，萌發率最高，為80.2%。，5 ℃、40 ℃條件下不能萌發。

圖3-a 不同溫度對菌絲生長的影響

圖3-b 不同溫度對孢子萌發的影響

2.7 不同pH值對菌絲生長和孢子萌發的影響

圖4-a結果表明：菌絲在pH值3～9條件下能生長，適宜的pH值范圍為4～7，pH值為5條件下生長最好，pH值分別為1、2、10、11條件下不能生長。圖4-b結果表明：分生孢子在pH值3～10的條件下均可萌發，適宜pH值范圍4～7，pH值為5條件下萌發最好，pH值分別為1、2、11條件下無法萌發。

圖4-a 不同pH值對菌絲生長的影響

圖4-b 不同pH值對孢子萌發的影響

2.8濕度對孢子萌發的影響

圖5顯示，孢子在相對濕度(RH)為50%-100%條件下均可萌發，RH 70%～90%適宜萌發，RH80%萌發最好，(RH)低于50%，孢子不能萌發。

圖5 不同濕度對孢子萌發的影響

3 小結與討論

擬莖點霉屬真菌是一類重要的植物病原真菌，大豆擬莖點種腐病菌能引起多種植物病害，目前報道的寄主植物除大豆外，還為害三葉草、綠豆、豌豆、花生、大蒜、洋蔥、辣椒、番茄、三裂葉豚草、蒼耳、小地錦草、皺葉酸模等[6]。筆者在傳統形態學鑒定的基礎上，通過對廣西莪術葉斑病病原菌的rDNA-ITS進行分析比對，從分子生物學水平上進一步明確擬莖點霉屬真菌—大豆擬莖點種腐病菌(Phomopsislongicolla)為廣西莪術葉斑病的病原真菌，發現該致病菌侵染廣西莪術為首次報道。

通過對廣西莪術葉斑病病原菌的生物學特性研究發現，該病原菌對營養的要求不嚴格，在多種培養基上均能生長良好，以PDA、莪術汁PDA培養基最為適合；菌絲生長及孢子萌發適宜溫度為20～30 ℃，偏弱酸性條件利于孢子萌發；孢子萌發需要一定的濕度，RH<50%不萌發，RH為80%時孢子萌發率最高。可見，該病原菌喜中溫、潮濕、偏弱酸性環境，在田間控制病害時應考慮病原菌的生物學特性進行。同時，關于該病原菌對碳氮源的利用等生物學特性，以及該病害的田間防治技術還有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：193.

[2] 曾建紅，陳旭，蔣小軍，等.廣西莪術揮發油抗腫瘤活性成分GC-MS研究[J].中華中醫藥雜志，2008，增刊：10.

[3] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[4] Graham G C，Mayser S P，Henry R J.A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J].Biotechniques，1994，16(1)：48-50.

[5] Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et a1.The CLUSTAL windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysistools[J].Nucleic Acids Research，1997，24：4876-4882.

[6] 張建成，顧建鋒，徐瑛，等.大豆擬莖點種腐病的研究進展及其檢疫意義[J].植物檢疫，2005，19(3)：163-167.

IdentificationofCurcumakwangsiensisLeafSpotPathogenandObservationofItsBiologicalCharacteristics

JIANG Ni*，LIULihui，HUFengyun，LIUWei，LIUFan

(GuangxiBotanicalGardenofmedicineplant，Nanning530023，China)

Objective：The study is aimed to iendtify the organism that leads to theCurcumakwangsiensisleaf spot andgrasp the biological characteristics of the pathogen.Methods：The fungus was isolated from infected plants according to Koch’s Rule.The identification of the pathogen was carried out mainly based on the morphological characters and molecular analysis of internal transcribed spacer(ITS)sequences；The effects of temperature，humidity，PH and nutrition on mycelial growth and conidialgermination of the pathogen were also investigated.Results：The morphological characters of the pathogenic isolate were in agreement withPhomopsissp.When compared with sequences in GenBank，the ITS sequence of the pathogen was 99% similar to that ofP.longicolla.On the condition of PH5～6，20～30 ℃ the fungal isolates grow bette and the more conidiums germinate.PDA medium with rhizomazedoariae juice was the optimum medium.Conclusion：The pathogen causingC.kwangsiensisleaf spot was identifidied asP.longicolla.The fungal isolates grow better on the condition of medium temperature，humidity and weak acid environment.

Curcumakwangsiensis；disease；pathogen identification；biological characteristic

2015-03-09)

廣西中醫藥科技專項(GZKZ1133)；南寧市科技成果推廣及產業化示范項目(201101074C)

*

蔣妮，副研究員，研究方向：藥用植物栽培病蟲害防治；Tel：(0771)5602461，E-mail：jiangni292@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.017