梔子褐斑病病原菌生物學特性研究△

羅光明，董艷凱，朱玉野，胡燕珍，龔雨虹，王曉云

(江西中醫藥大學 藥學院，江西 南昌 330004)

·中藥農業·

梔子褐斑病病原菌生物學特性研究△

羅光明，董艷凱，朱玉野*，胡燕珍，龔雨虹，王曉云

(江西中醫藥大學 藥學院，江西 南昌 330004)

從梔子植株褐斑病葉片病變部位分離到的病原菌。經致病性測定確定該病原菌為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria的葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea。本試驗研究了病原菌的生物學特性，包括不同溫度、光照時間、pH值、碳氮源營養對菌絲生長和子實體萌發的影響，并確定了菌絲和子實體的致死溫度。結果表明，菌絲生長的溫度范圍為10～35 ℃，最佳生長溫度為30 ℃，菌絲在pH 4～10范圍內均能生長，最適pH為5。適宜菌絲生長的碳、氮源分別為可溶性淀粉和酵母膏。光暗交替條件下更適合菌絲生長。子實體在15～40 ℃范圍內均可萌發，最佳溫度為25 ℃。在pH 3～11范圍內子實體均能萌發，最佳pH為9。子實體萌發的最佳碳、氮源分別為可溶性淀粉和硝酸鈣。黑暗條件下適宜菌核萌發。子實體和菌絲的致死溫度均為60 ℃。

梔子；褐斑病；生物學特性

梔子為茜草科(Rubiaceae)植物梔子GardeniajasninoidesEllis的干燥成熟果實，始載于《神農本草經》，性味苦寒，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效，臨床上常用于治療熱病心煩、濕熱黃疸、血淋澀痛、血熱出血、火毒瘡瘍以及扭挫傷等病證[1]。目前，從梔子屬植物中分離鑒定出的化合物主要有環烯醚萜類、多糖類、黃酮類、醇類、有機酸酯類、長鏈烷烴類、和醛類等[2]。梔子目前正值需求旺季，近期市場貨源走動較好，價格不斷走高，近年來各藥廠相繼開發出以梔子為主要原料的新的中成藥，從而加大了梔子的藥用需求量。同時，梔子還被廣泛應用于釀酒、香料制造，也被用以提取天然染料和食用色素，還被開發成香水等產品。國外對梔子的需求量也在呈上升趨勢，梔子出口數量不斷增大，具有很好的市場前景。

褐斑病是梔子常見的病害之一，全年都可發生，嚴重時植株落葉、落果或枯死[3]。從而導致梔子產量嚴重下降。從病變部位分離出的致病菌為葡萄座腔菌，姜曉龍[4]曾對葡萄座腔菌進行系統鑒別，李冬[5]曾對病原菌進行過報道，但至今未見梔子褐斑病病原菌生物學特性的研究報道。為明確梔子褐斑病病原菌生物學特性，了解其所致病害的發生規律和制定有效的防治措施提供理論依據。本試驗調查、采集、分離了梔子褐斑病的病原菌，對褐斑病病原菌的生物學特性進行了較為系統的研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

梔子褐斑病病原菌為病變組織經常規組織分離法[6]分離培養得到，確定為葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea。

1.2 生物學特性研究

1.2.1 不同溫度對菌絲體生長和子實體萌發的影響 用直徑無菌打孔器從生長4 d的菌落邊緣打取直徑6 mm的菌絲塊，接種于PDA平板上，每皿接種1個菌絲塊。分別于4、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下黑暗培養，每個處理設置3個重復。96 h后用十字交叉法測量菌落直徑。

由培養30 d的成熟菌落挑取子實體，接種于PDA平板上，每皿20粒，4次重復，培養條件與菌絲培養條件相同，接種36 h后觀察子實體萌發情況，統計子實體萌發率。

1.2.2 不同pH值對病原菌菌絲體生長和子實體萌發的影響 PDA培養基滅菌后，在無菌條件下用滅菌的1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液調節PDA培養基酸堿度，設置3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共9個pH梯度處理。打取直徑為6 mm菌絲塊接種在不同pH值的PDA平板中央，每處理重復3次，置于30 ℃黑暗條件下恒溫條件下培養。72 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

由培養30 d的成熟菌落挑取子實體，接種于不同pH的PDA平板上，每皿20粒，4次重復，25 ℃恒溫培養，36 h觀察子實體萌發情況，統計子實體萌發率。

1.2.3 不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長和子實體萌發的影響 以查彼克培養基(2.0 g KNO3，1.0 g KH2PO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4.7H2O，0.01 g FeSO4，30.0 g蔗糖，1000 mL蒸餾水)為基礎，用含有同等質量碳元素的其他碳源(肌醇、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露糖、乳糖、木糖醇)取代培養基中的蔗糖，制成含有不同碳源的培養基，制作平板時每1000 mL培養基加入15 g瓊脂。打取直徑為6 mm的菌絲塊接種在不同碳源的培養基。以不加任何碳源為對照，每處理3個重復，置于30 ℃黑暗條件下恒溫培養箱培養。96 h后用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌體生長情況。

由培養30 d的成熟菌落挑取子實體，接種于不同碳源的PDA平板上培養基，每皿20粒，4次重復，25 ℃恒溫培養，36 h觀察子實體萌發情況，統計子實體萌發率。

以查彼克培養基為基礎，用含有相同質量氮元素的不同氮源(NaNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl、酵母膏、尿素、KNO3、蛋白胨)代替其中的KNO3，配成含有不同氮源的液體培養基。打取直徑為6 mm的菌絲塊接種于含不同氮源平板的中央。以不加任何氮源為對照，每處理3個重復，置于30 ℃黑暗條件下恒溫培養箱培養。96 h后用十字交叉法測量菌落直徑并觀察菌體生長情況。

由培養30 d的成熟菌落挑取子實體，接種于不同氮源的PDA平板上培養基，每皿20粒，4次重復，25 ℃恒溫培養，36 h觀察子實體萌發情況，統計子實體萌發率。

1.2.4 光照對菌絲生長和子實體萌發的影響 將已接種的PDA培養皿分為3組，作如下處理：(1)30 ℃持續光照培養24 h(光照培養箱)；(2)30 ℃持續黑暗培養24 h；(3)30 ℃黑暗12 h與光照12 h交替培養24 h。96 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

由培養30 d的成熟菌落挑取子實體，光照時間設定同菌絲，每皿20粒，4次重復，25 ℃恒溫培養，36 h觀察子實體萌發情況，統計子實體萌發率。

1.2.5 菌絲體與子實體的致死溫度測定 菌絲體的致死溫度測定：挑取已在液體培養中生長成熟的菌絲塊，置于同等大小的已滅菌試管中，加入10 ml無菌水。分別于40、45、50、55、60、65 ℃恒溫水浴10 min，用流動水快速冷卻試管。取出菌絲接種于PDA平板上30 ℃黑暗條件下培養，2 d后觀察并記錄菌絲生長情況。每個處理設置4次重復。設未經水浴處理的菌絲塊作空白對照。子實體的致死溫度測定：收集PDA培養基上萌發初期的成熟子實體。分別置于40、45、50、55、60、65 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，用冷水迅速冷卻試管。將子實體轉入PDA平板中，每皿4粒，25 ℃恒溫培養。48 h后根據子實體生長情況確定其致死溫度。

1.2.6 數據統計與分析 用GraphPad Prism軟件分析溫度、pH值、不同碳源、氮源和光照時間對病原菌菌絲生長和子實體萌發的影響并作圖。用spss19.0比較不同處理的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 溫度對病原菌菌絲體生長及子實體萌發的影響

圖1(A)表明，葡萄座腔菌對溫度的適應范圍較廣。在10、15、20、25、30、35下培養96 h后的菌落直徑分別為1.16、3.34、5.72、6.39、7.78、1.63 cm，4 ℃和40 ℃未見菌絲生長，菌落在不同溫度的擴展速度不同，適宜溫度為20～30 ℃，此溫度范圍內菌絲生長致密，20 ℃以下或35 ℃以上菌落生長明顯趨緩。4 ℃和40 ℃條件下菌落直徑無顯著性差異(P>0.05)，其余各組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。子實體萌發率測定結果表明，不同溫度下子實體萌發差異顯著，10～40 ℃范圍內子實體均可萌發，4 ℃條件下子實體不能萌發。25 ℃最為適宜，子實體萌發率為78.75%，見圖1(B)，此溫度下子座生長也較為迅速。4 ℃與10 ℃，10 ℃與15 ℃，20 ℃與30 ℃、35 ℃、40 ℃的子實體萌發率無顯著性差異(P>0.05)，其余不同溫度之間的子實體萌發率存在顯著性差異(P<0.05)

2.2 不同pH值對病原菌菌絲體生長和子實體萌發的影響

葡萄座腔菌對酸堿度的適應范圍較廣，在PH 4-10范圍內均能生長，PH3和PH11環境下均不能生長，適宜菌落擴展的PH范圍為PH4～7，在此范圍內菌落生長迅速，菌絲生長致密，長勢繁茂。最適P為5，在此條件下生長72 h后的菌落直徑為5.27 cm。PH3和PH11、PH4～7、PH9和PH10條件下菌落直徑無顯著性差異(P>0.05)，其余各組之間兩兩均存在顯著性差異(P<0.05)。在PH 3～11范圍內子實體均能萌發，堿性條件下更適宜子實體萌發，pH9時子實體萌發率最高，為62.5%，顯著高于其他PH值，在PH8～10范圍內子實體萌發率較高，見圖2。PH3、PH4、PH5、PH11之間，PH6、PH7、PH10之間，PH8、PH10之間的子實體萌發率無顯著性差異(P>0.05)，其余各不同PH之間的子實體萌發率存在顯著性差異(P<0.05)。

圖1 溫度對菌絲體生長(A)和 子實體萌發(B)的影響

圖2 pH對菌絲體生長(A)和子實體萌發(B)的影響

2.3 不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長和子實體萌發的影響

圖3結果表明，葡萄座腔菌對不同氮源利用差異顯著，以可溶性淀粉為碳源時菌絲生長最為迅速，培養96 h之后的菌落直徑為7.47 cm，菌落較為致密，與其他碳源處理存在顯著差異。其次為蔗糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖，對木糖醇、半乳糖、肌醇的利用較差。以木糖醇為碳源時菌絲生長最慢，菌落稀疏，生長狀況差。以蔗糖為碳源時，菌落厚度最為致密(見表1)，但菌落生長速度較為緩慢，綜合考慮可溶性淀粉為最適碳源。乳糖、葡萄糖、麥芽糖之間，肌醇、木糖醇、半乳糖之間，蔗糖、甘露糖之間菌落直徑不存在顯著性差異(P>0.05)，其余不同炭源之間的菌落直徑均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 不同碳源對菌絲體生長(圖A)和 子實體萌發(圖B)的影響

子實體萌發對9種碳源利用差異顯著，可溶性淀粉和葡萄糖利用最好，子實體萌發率分別為62.5%、61.25%。其次為蔗糖、麥芽糖、半乳糖、木糖醇。乳糖、肌醇、甘露糖對子實體萌發的效果較差。乳糖、肌醇、甘露糖、空白之間，蔗糖、木糖醇、半乳糖、麥芽糖之間，葡萄糖、淀粉之間的子實體萌發率無顯著性差異(P>0.05)，其余各碳源之間的子實體萌發率均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖4 不同氮源對菌絲體生長(圖A)和 子實體萌發(圖B)的影響

葡萄座腔菌對供試的氮源均能利用，但對不同氮源的利用率存在顯著差異。圖4結果顯示，供試菌株在尿素和酵母膏作為氮源的培養基生長速度最快，培養96 h之后的菌落直徑分別為7.32 cm和7.34 cm，硝酸鉀、硝酸鈉、氯化銨、硝酸鈣之間，尿素、酵母膏，氯化銨、蛋白胨之間菌落直徑無顯著差異(P>0.05)，其余各氮源之間菌落直徑存在顯著性差異(P<0.05)。以酵母膏作為氮源的菌落更為致密，因此酵母膏為最適氮源，其次為尿素。無氮源存在時菌落厚度很小。以硝酸鈣作為氮源時子實體萌發率最高，達到67.5%。其次為蛋白胨，子實體萌發率可達到63.75%，硝酸鈉作為氮源時子實體的萌發率最低，只有47.5%。空白組與其他各氮源之間的子實體萌發率均存在顯著性差異(P<0.05)。硝酸鈣與硝酸鉀、硝酸鈉、酵母，蛋白胨與酵母之間的子實體萌發率存在顯著性差異(P<0.05)，其余各氮源之間的子實體萌發率無顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

注：“+”表示菌落生長稀薄，菌落厚度依次有“+”、“++”、 “+++”。

2.4 光照對菌絲生長和子實體萌發的影響

試驗結果表明，不同光照時間對菌絲生長的影響不明顯，黑暗條件菌絲生長速度略高于光暗交替和全光照條件。黑暗條件和光暗交替處理的菌落直徑無顯著性差異(P>0.05)，其余各組之間存在顯著性差異(P<0.05)。從子實體萌發率來看，黑暗條件最優，光照條件和光暗交替子實體萌發率均顯著降低，分別為23.75%和35%，見圖5。不同光照時間的子實體萌發率之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

2.5 菌絲體與子實體的致死溫度

結果表明，經40～55 ℃處理10 min之后的子實體和菌絲均能正常生長，菌絲60 ℃水浴10 min后完全致死，經60 ℃水浴10 min之后的子實體接種到PDA培養基之后不再生長，故子實體和菌絲的致死溫度均為60 ℃水浴10 min。

3 結果與討論

目前有關梔子褐斑病病原菌生物學特性方面的系統資料相對較少，因此，進行病原菌的生物學特性試驗有重要的意義。本試驗結果表明，葡萄座腔菌可不同程度的利用多種碳源和氮源，最適宜子實體萌發的碳源和氮源分別為淀粉和硝酸鈣，最適宜

圖5 不同光照時間對菌絲體生長(圖A)和 子實體萌發(圖B)的影響

處理溫度(℃)菌絲生長情況子實體生長情況ck++++++++40℃++++++++45℃++++++++50℃++++++++55℃++++++++60℃--------65℃--------

注：“+”表示生長；“-”表示不生長。

菌絲生長的碳源和氮源分別是可溶性淀粉和酵母膏，施用過多氮肥既會造成草坪草徒長，又會加劇根腐病的發生，因此，少施氮肥對控制該病害的發生有顯著作用。光照試驗可以得出，黑暗條件有利于病害的蔓延，光照條件病害發生較慢。病原菌在10～35 ℃均能生長，20～30 ℃為菌絲生長的適宜范圍，與董一丹[7]報道的褐斑病通常在較溫暖(>25 ℃)、濕度較大的夏天發生相一致。菌絲和子實體的致死溫度均為60 ℃處理10min，可能原因為其寄主及生長環境不同或是菌群分化等原因，使得病原菌某些生物學特性也具有一定的差異，尚待深入研究[8]。

葡萄座腔菌生長的最適pH為5，說明偏酸性土壤上的草坪發病重于堿性土壤，改善土壤酸堿度可以有效預防該病害的發生。

在生產上應采取綜合的管理和防治措施，病害發生前后，積極做好預防和防治工作等，將病害發生程度降低到最低水平。本試驗的研究結果對于有針對性地擬定病害防治措施具有一定的參考意義。

[1] 劉益華，李晶，林曼婷，等.梔子有效成分梔子苷的現代研究進展[J].中國藥學雜志.2012，47(6)：406-409.

[2] 顏升，董艷凱，陳健，等.中藥梔子的研究現狀[J].安徽農業科學.2013，41(18)：7759-7760，7772.

[3] 李國元，鄧青云.梔子主要病害發生特點及綜合防治[J].湖北林業科技.2003(3)：24-26.

[4] 姜曉龍，金磊磊，陳輝輝，等.1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鑒定[J].江蘇農業科學.2015，43(2)：319-322.

[5] 李冬，劉興平.梔子病害調查及病原鑒定初報[J].江西林業科技.2009，(5)：31-32.

[6] 古麗君，徐秉良，李彬，等.草坪禾草根腐病病原菌生物學特性研究[J].草業學報，2012，21(3)：93-98.

[7] 董一丹.高羊茅褐斑病的病原學及防治技術研究[D].武漢：華中農工業大學.2006.

[8] 陳海波.草坪草褐斑病病原鑒定及化學防治研究[D].蘭州：甘肅農業大學.2001.

StudyonBiologicalCharacteristicsGardeniaLeafSpot

LUO Guangming，DONG Yankai，ZHU Yuye*，HU Yanzhen，GONG Yuhong，WANG Xiaoyun

(JiangxiUniversityoftraditionalChinesemedicinecollegeofpharmacy，Nanchang330004，China)

Leaf spot lesions pathogens were isolated from gardenia plants，which were identified asBotryosphaeriadothidea.The experiment studied the biological characteristics of pathogens，including different temperature，illumination time，pH，carbon and nitrogen source for mycelial growth and sclerotia nutrition germination and determine the mycelium and sclerotia lethal temperature.The results showed that mycelial growth temperature ranged from 10～35 ℃，the optimum growth temperature was 30 ℃，the mycelium could grow within pH 4 to pH 10，the optimum pH value was pH 5.Suitable carbon and nitrogen sources for mycelial growth were soluble starch and yeast extract.Alternating light and dark condition was more suitable for mycelial growth.Sclerotia could germinate at the range of 15 ℃ to 40 ℃，and the optimum temperature was 25 ℃.In sclerotia could germinate at the range of pH 3 to pH 11，and the optimum pH value is pH 9.Soluble starch and calcium nitrate were the optimum carbon and nitrogen sources for the germination of sclerotia.Under dark conditions it was suitable for military and germination.The lethal temperatures of sclerotia and mycelium are 60 ℃.

Gardenia；biological characteristics；leaf spot

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.016

2015-10-22)

國家公益性行業科研專項資助項目(201507002)。

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朱玉野，講師，研究方向：藥用植物；E-mail：zyy711@126.com