肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的制備及體外透皮實驗△

許歡歡，胡君萍，吳姍姍，朱丹丹，居博偉 ，曹丹丹，楊建華

(1.新疆醫(yī)科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

·中藥工業(yè)·

肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的制備及體外透皮實驗△

許歡歡1，胡君萍1，吳姍姍1，朱丹丹1，居博偉1，曹丹丹1，楊建華2*

(1.新疆醫(yī)科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：制備以肉蓯蓉苯乙醇總苷為功能成分的美白防曬透皮吸收新劑型傳遞體，并對其進行質(zhì)量評價及體外透皮性能的研究。方法：采用均勻設計篩選逆相蒸發(fā)法制備肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的最佳處方，并對傳遞體的粒徑、形態(tài)、電位和穩(wěn)定性進行評價。采用改良的Franz擴散池考察其透皮效率以及24 h累積釋放量情況。結(jié)果：均勻設計篩選逆相蒸發(fā)法的最佳處方為卵磷脂與藥物的質(zhì)量比140∶10，卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比140∶15，卵磷脂與膽酸鈉的質(zhì)量比為140∶33，油相與水相的體積比2.49。制得的傳遞體為淡黃色半透明混懸液，平均包封率為37.5%。在電鏡下觀察其外形呈較規(guī)則的球形或類球形，光滑且不黏連，平均粒徑190.7 nm，Zeta電位為-35.93 mV。于4 ℃下放置60 d，未產(chǎn)生聚積或沉淀。肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的穩(wěn)態(tài)滲透速率與24 h的累積透皮量均大于肉蓯蓉苯乙醇苷飽和水溶液。結(jié)論：肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的制備工藝可行，以傳遞體為載體可以增加肉蓯蓉苯乙醇苷透皮轉(zhuǎn)運和皮膚的滯留量，為肉蓯蓉苯乙醇總苷在美白防曬化妝品中的應用提供了透皮吸收新劑型。

肉蓯蓉；苯乙醇總苷；傳遞體；均勻設計；體外透皮

黑色素是影響膚色的最主要因素，其合成過多會引起雀斑、黃褐斑等。其次，過多接觸紫外線可導致皮膚皺紋增多、皮膚光老化、皮膚癌變等一系列皮膚疾病。隨著“回歸大自然”的理念日漸深入人心，天然美白防曬產(chǎn)品的開發(fā)已成為化妝品領域一個研究熱點。課題組前期研究顯示[1-2]，肉蓯蓉苯乙醇總苷對人體黑素合成的主要限速酶—酪氨酸酶的活性具有明顯的抑制作用，以肉蓯蓉苯乙醇總苷為主要功能成分的乳劑對中波紫外線(UVB)照射致小鼠皮膚色素沉著光老化模型具有顯著保護作用。通過進一步的研究，課題組又從肉蓯蓉中提取分離得到了純度高、制備量較大的系列苯乙醇苷衍生物，并以對人皮黑素細胞增殖活性及黑素合成含量的影響為指標對系列苯乙醇苷衍生物的抑制皮膚色素沉著作用做了初步考察。結(jié)果表明，它們均能顯著抑制人皮黑色素細胞的增殖活性，同時還可明顯降低人皮黑色素細胞黑素的含量。以上研究表明，苯乙醇苷是肉蓯蓉具有美白、防曬功能的主要物質(zhì)基礎。

目前對肉蓯蓉苯乙醇總苷透皮給藥的研究未見報道，鑒于其本身具有的特殊功能，合理設計肉蓯蓉苯乙醇苷透皮給藥制劑有現(xiàn)實意義。傳遞體是在脂質(zhì)體基礎上，在磷脂成分中加入膽酸鈉等表面活性劑制備成的自聚泡囊。其有高親水性、高滲透性和高效變形性等特點，能使目標藥物更易穿過角質(zhì)層或表皮類脂，增強藥物在皮膚局部積累，從而起到皮膚靶向與藥物持續(xù)釋放的效果，傳遞體是透皮效果優(yōu)于脂質(zhì)體的新型經(jīng)皮滲透載體[3]。為改善苯乙醇苷的透皮吸收效果，充分發(fā)揮藥效，本研究制備了肉蓯蓉苯乙醇總苷的新劑型傳遞體，并對其質(zhì)量進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-200VDB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子天平(METTLER)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津)；pH計(METTLER TOLEDO)；RH basic2磁力攪拌器、MS3 basic渦旋儀(IKA)；Nano-ZS90馬爾文粒度激光儀(Malvern)；TT-6B透皮吸收擴散儀(天津正通科技有限公司)。

1.2 試藥

松果菊苷對照品(自制，UV、IR、EI-MS、1H NMR和13C NMR 數(shù)據(jù)符合文獻值[4]，經(jīng)HPLC面積歸一化法測定純度大于98%)；肉蓯蓉總苷(自制，UV法測得肉蓯蓉苯乙醇總苷含量高達87%，HPLC測得松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分別為37.8%、17.7%)；大豆卵磷脂、膽固醇(上海藍季科技發(fā)展有限公司)；膽酸鈉(北京奧博星生物技術有限公司)；葡聚糖凝膠(G-50，瑞典Pharmacia公司進口分裝)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體含量測定方法的建立

2.1.1 逆相蒸發(fā)法制備肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體精密稱取適量大豆卵磷脂、膽固醇置于茄形瓶中，加適量三氯甲烷充分溶解，于37 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮去三氯甲烷。待三氯甲烷揮盡后繼續(xù)抽真空約40 min，取下茄形瓶加入適量膽酸鈉和肉蓯蓉苯乙醇總苷混合溶液，于37 ℃水化2 h，水化全后即得肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體，依次通過0.45、0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.1.2 測定波長的選擇 分別掃描松果菊苷對照品異丙醇溶液和肉蓯蓉苯乙醇總苷傳質(zhì)體、肉蓯蓉苯乙醇總苷、空白傳遞體(除不加肉蓯蓉苯乙醇總苷外，其余同2.1.1項下操作)3種供試品異丙醇溶液的紫外光譜圖，結(jié)果前三者的紫外圖譜基本一致，空白不干擾，最大吸收波長均為333 nm。故選擇松果菊苷為對照品，采用紫外光譜法測定苯乙醇總苷的含量。

2.1.3 標準曲線的制備 精密稱取松果菊苷對照品1 mg，溶于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的松果菊苷對照品溶液。分別精密吸取適量對照品溶液于5 mL量瓶中，用異丙醇定容至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為4.72、11.80、18.88、25.96、33.04 μg·mL-1的溶液，于333 nm處測定吸光度值。以吸光度值對濃度進行線性回歸，得標準曲線方程：Y= 0.026 0X+0.015 3，r= 0.999 5。表明在4.72～33.04 μg·mL-1吸光度與濃度呈良好線性關系。

2.1.4 精密度試驗 配制高、中、低3個濃度的松果菊苷對照品溶液，1 d內(nèi)于不同時間測定333 nm處吸光度，結(jié)果日內(nèi)RSD分別為0.78%、0.92%、0.89%(n=6)；連續(xù)5 d測定吸光度值，結(jié)果日間RSD 分別為 0.72%、0.26%、0.23%(n=5)。表明其日內(nèi)及日間精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 精密移取肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體1 mL，用異丙醇超聲溶解，并用異丙醇定容到10 mL，即為肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體供試品溶液。按照上述操作平行制備6份，測定吸光度，結(jié)果RSD = 0.67%，表明方法重復性良好。

2.1.6 回收率試驗 取肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體0.5 mL，分別加入高、中、低濃度的松果菊苷對照品溶液，加異丙醇超聲破乳并定容，分別平行試驗3份，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n = 9)

2.1.7 包封率的測定 預試驗中發(fā)現(xiàn)，采用凝膠柱色譜法可以將包裹好的傳遞體與未包裹的藥物完全分離，回收率可達到99.59%，故選擇凝膠柱色譜法測定傳遞體包封率[5]。取制備好的傳遞體1 mL，上樣于凝膠柱，用pH 6.8的磷酸緩沖液洗脫，接收15～40 mL的洗脫液，定容至50 mL容量瓶，紫外法測游離藥量。另取1 mL傳遞體樣品于50 mL量瓶內(nèi)，加入少許異丙醇超聲破乳，再加磷酸鹽定容至刻度，測總藥量。計算包封率EE(%)。

2.2 肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體制備方法的考察

分別采用薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法和乙醇注入法制備肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體，測定不同制備方法所得傳遞體中藥物的包封率。

2.2.1 薄膜分散法 定量稱取豆磷脂、硬脂酸置茄形瓶中，加入乙醚，振搖，使完全溶解，得類脂溶液。將茄形瓶置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于45 ℃減壓蒸發(fā)溶劑，使形成均勻薄膜，另將肉蓯蓉苯乙醇總苷、膽酸鈉溶于磷酸鹽緩沖液，加入上述茄形瓶，常壓旋轉(zhuǎn)洗膜，以0.45、0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體。

2.2.2 逆相蒸發(fā)法 定量稱取卵磷脂、膽固醇于圓底燒瓶中，加乙醚溶解，另取肉蓯蓉苯乙醇總苷、膽酸鈉溶于磷酸鹽緩沖液，再與上述乙醚溶液混合，磁力攪拌器使形成W/0型乳劑，45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除三氯甲烷，得半固體膠狀物，再以適量磷酸鹽緩沖液水合，以0.45、0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體，測定包封率。

2.2.3 乙醇注入法 定量稱取肉蓯蓉苯乙醇總苷、卵磷脂、膽酸鈉、膽固醇，加乙醇使完全溶解，在不斷攪拌下，緩慢注入60 ℃磷酸鹽緩沖液中，加完后繼續(xù)攪拌1 h至乙醇揮盡。以0.45、0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體，測得包封率。

按2.1.7項下操作，測定以上3種制備方法制備的傳遞體中藥物的包封率，結(jié)果見圖1。逆向蒸發(fā)法制備的傳遞體中藥物的包封率最高。

圖1 制備方法對肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體包封率的影響

2.3 均勻設計試驗優(yōu)化處方

采用逆相蒸發(fā)法制備傳遞體，根據(jù)預試驗結(jié)果，篩選出制備肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體時影響其包封率的4個主要因素：藥與卵磷脂質(zhì)量比(X1)、膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比(X2)、膽酸鈉與卵磷脂的質(zhì)量比(X3)、油相與水相的體積比(X4)，故采用 U9(94)均勻試驗優(yōu)選工藝條件，見表2。

采用均勻設計軟件進行多元回歸處理，得回歸方程：Y= -19.067 4 + 12.519 7X3+ 5.953 4X4+ 0.315 3X1X2- 0.098 2X1X3-0.673 4X2X3-0.599 1X3X3- 1.193 3X4X4。回歸方程顯著性檢驗：F=1.837 1×104，r= 0.999 9 (p< 0.01)，優(yōu)化值：X1= 14∶1；X2= 9∶1；X3= 4.243∶1；X4= 2.494∶1。預測最大值為38.875%。

表2 均勻設計結(jié)果(n = 9)

2.4 驗證試驗

按優(yōu)選處方制備3批肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體，測定包封率，見表3。結(jié)果驗證值與預測值接近。

表3 樣品包封率測定結(jié)果(n = 9)

2.5 質(zhì)量評價

肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體外觀淡黃色，略帶乳光的混懸液，在透射電鏡下，形態(tài)呈完整圓球形或橢圓形的球粒，表面光滑、形狀規(guī)則、分散性好，相互之間沒有聚集現(xiàn)象。見圖2。采用激光散射粒徑測定儀測定傳遞體的粒徑、分布及Zeta電位，結(jié)果平均粒徑為182 nm，分布均勻，見圖3。Zeta電位為-35.93 mV。于4 ℃下放置60 d未產(chǎn)生聚積或沉淀，表明該傳遞體具有較好的聚結(jié)穩(wěn)定性。

圖2 肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的電鏡圖

圖3 肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體的粒徑分布圖

2.6 肉蓯蓉苯乙醇總苷體外透皮實驗

2.6.1 鼠皮的制備 取健康雄性小白鼠(20 g左右)，用剪刀仔細剪去腹部皮膚上的毛，斷頸處死，剝離腹部皮膚。將剝離下來的皮膚平鋪于玻璃板上，角質(zhì)層向下，用單背刀片小心剔除皮下脂肪和粘連物，然后用0.9%氯化鈉溶液反復沖洗干凈，剪成適當?shù)拇笮。z查皮膚的完整性。每次實驗前，檢查鼠皮的完整性，不得有任何破損。

2.6.2 累積透過量和透皮吸收速率的測定 將皮膚固定在擴散池的上、下兩室之間，角質(zhì)層朝上，接受液為0.9%氯化鈉溶液，供給池加入肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體或肉蓯蓉苯乙醇總苷水溶液1 mL，用保鮮膜覆蓋池口。將透皮吸收擴散裝置置于37 ℃恒溫水浴中，開動攪拌(200 r·min-1)，計時，分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣3 mL，同時補加相同溫度等體積新鮮接受液，檢測樣品溶液中藥物的含量，根據(jù)下式求累積滲透量Qn。以Qn對t作圖，進行線性回歸，求直線斜率，即為穩(wěn)態(tài)滲透速率Jss[6]。見圖4。

[Qn：第n小時松果菊苷的累積滲透量，V0：接收池體積(mL)，V：取樣體積，Cn：第n小時接收池中的濃度]

圖4 不同制劑累積釋藥量對時間(Q—T) 的滲透動力學曲線

不同肉蓯蓉苯乙醇總苷的透皮制劑方程r24hQn(μg·cm-2)Jss(μg·cm-2·h-1)載藥傳遞體Qn=13824t+26790093972235627±203413824±129飽和水溶液Qn=11384t+42013098272061574±257111384±157

結(jié)果表明，肉蓯蓉苯乙醇苷傳遞體的滲透速率為13.824 μg·cm-2·h-1，累計釋放量為223.563 μg·cm-2，與飽和水溶液相比，肉蓯蓉苯乙醇苷傳遞體具有更快的滲透速率。

3 討論

制備水溶性藥物傳遞體，采用逆相蒸發(fā)法通常有著更高的包封率，而該方法工藝過程中能否形成穩(wěn)定的W/O乳劑至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，采用三氯甲烷與乙醚混合溶劑為有機溶劑，更容易形成W/O乳劑且不易分層。文獻表明[8]，油水比通常在3∶1～6∶1范圍內(nèi)利于成乳，本試驗中油水比1∶1即可成乳，可能與膽酸鈉加入有關，膽酸鈉本身也是一種乳化劑，利于乳劑的形成。

藥物自身的理化性質(zhì)對包封率影響很大。對于被動載藥法(薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法)脂溶性或水溶性(logP<-0.3或logP>4.5)特別高的藥物可被包封成具有較高包封率的脂質(zhì)體。苯乙醇總苷的油水分布系數(shù)約為1，故制得的傳遞體中藥物的包封率較低。

破乳劑破乳效果的好壞直接影響包封率測定的準確性。本實驗比較了甲醇、無水乙醇、異丙醇等常用的破乳劑，結(jié)果表明，異丙醇的破乳效果最佳，與甲醇、無水乙醇相比用量小，破乳后，藥物的回收率高。這可能是由于有機溶劑破乳的機制是基于極性相似相容原理，傳遞體膜材的主要成分為卵磷脂，其極性較小，在異丙醇中更易被溶解。

傳遞體是將膜軟化劑(主要是以膽酸鹽為主的表面活性劑)加入到類脂材料中，制成的新型多功能透皮藥物載體，具有高效滲透性、高度柔韌性、高度自身形變性，可高效穿過比其小數(shù)倍的皮膚孔道。表面活性劑的添加與否是傳遞體與常規(guī)脂質(zhì)體最主要的區(qū)別[7]。由于磷脂分子中有不飽和脂肪酸鏈，過高的溫度下游離離子等會使磷脂疏水鏈斷裂，分子膜流動性降低，藥物泄漏加劇，故本實驗考察了膽酸鈉對傳遞體穩(wěn)定性與包封率的影響。結(jié)果表明，使用膽酸鈉作為表面活性劑，當膽酸鈉與磷脂比為1∶4時，制備的傳遞體包封率最高，穩(wěn)定性也較好。

均勻設計試驗表明，類脂材料的增加可以提高藥物的包封率：一方面，類脂越多，藥物被包裹的幾率越大；另一方面，卵磷脂帶負電荷，卵磷脂越多，所帶的負電荷越多，由于同電荷的相互排斥，使雙分子間的距離增大，易包裹更多親水的藥物。但類脂的加入量也不宜過多，否則會導致傳遞體的粒徑偏大，引起聚集，使制劑的穩(wěn)定性顯著下降。

體外透皮實驗顯示，肉蓯蓉苯乙醇總苷傳遞體與苯乙醇總苷飽和水溶液相比具有較高的透皮滲透速率，這主要是基于傳遞體的高度變形性和親水性。良好的透皮滲透效果使藥物能夠發(fā)揮更高的藥效。

[1] 楊建華，胡君萍，熱娜·卡斯木，等.肉蓯蓉苯乙醇總苷對酪氨酸酶活性的抑制作用[J].華西藥學雜志，2010，25(5)：533-535.

[2] 楊建華，胡君萍，劉盟.蓯蓉美白防曬霜的制備及其質(zhì)量評價研究[J].華西藥學雜志，2011，26(3)：312-315.

[3] Ahad A，Aqil M，Kohli K，et al.Formulation and optimization of nanotransfersomes using experimental design technique for accentuated transdermaldelivery of valsartan[J].Nanomed：Nanotechnol，Biol，Med，2012，8 (2)：237-249.

[4] Kobayashi H，Karasawa H，Miyase T，et al.Studies on the constituents of Cistanchis herba (Ⅲ)[J].Chem Pharm Bull，1984，32 (8)：3009.

[5] 陸曉紅，劉建平，趙華，等.丹參酮脂質(zhì)傳遞體的制備及體外經(jīng)皮滲透研究[J].中成藥，2005，27(9)：1000-1003.

[6] 郭偉英，聶傳平，曹洪昭.布洛芬傳遞體的制備及體外透皮研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(3)：191-193.

[7] 王梅，高曉黎.肉蓯蓉總苷前體脂質(zhì)體的研制[J].新疆醫(yī)科大學學報，2007，30(1)：43-45.

[8] 曾燦麗.鹽酸去氫駱駝逢堿傳遞體透皮給藥系統(tǒng)及泡囊透皮給藥系統(tǒng)的研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學，2013.

PreparationofPhenylethanoidGlycosidesTransfersomesandTransdermalExperimentsinvitro

XU Huanhuan1，HU Junping1，WU Shanshan1，ZHU Dandan1，JU Bowei1，CAO Dandan1，YANG Jianhua2*

(1.CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；2.TheFirstAffiliatedHospital，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：The present study was designed to develop a transfersomes formulation of phenylethanoid glycosides (PG) for skin lightener and sunscreen，further evaluate the qualities and study on transdermal resorptioninvivo.Methods：Uniform design was applied to optimize the formulation of reverse phase evaporation.The particle size，appearance，Z-potential，and the stability of formulation were also evaluated，respectively.Using modified Franz diffusion cell and UV spectrophotometric method for the determination of receiving solution PG content，the penetration efficiency of skin and 24 h cumulative release were evaluated amount.Results：The optimum prescription of the uniform design were as follows：the ratio of soya lecithin/PG was 200∶30，lecithin/cholesterol was 140∶15，oil phase/water phase was 2.49，respectively.The obtained transfersomes were light yellow translucent suspension，with a mean encapsulation efficiency of 37.5%.The shape of the particles was spherical or spherical-likely under microscope，which was smooth and non-conglutinated with an average diameter of 190.7 nm，and a Z-potential of -35.93 mV.Aggregation or deposition was not observed after exposure under the temperature of 4℃ for 60 d.The cumulative amount of PG and the permeability coefficient in the transfersomes were higher than that of PG in the control solution.Conclusion：The preparation technology of PG is feasible，transfersomes as the carrier can increase the PG through transporter skin retention and provides a new dosage form of transdermal absorption for PG in whitening sunscreen cosmetics application.

Cistanche；phenylethanoid glycosides；transfersomes；uniform design；Franz diffusion

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.018

2016-01-15)

國家自然科學基金項目(81360670，81560629)；新疆維吾爾自治區(qū)優(yōu)秀青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目(2014721050)

*

楊建華，教授，研究方向：天然藥用資源的開發(fā)與利用；E-mail：yjh-yft@163.com