基于ITS2序列的維吾爾藥材蜀葵及其近緣種鑒定研究△

樊叢照，坤杜孜·阿依，李曉瑾

(新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

·專題·

基于ITS2序列的維吾爾藥材蜀葵及其近緣種鑒定研究△

樊叢照，坤杜孜·阿依，李曉瑾*

(新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：研究蜀葵與藥蜀葵特征DNA序列的差異，為鑒定維吾爾藥材蜀葵及藥蜀葵提供依據。方法：采用試劑盒法提取蜀葵及藥蜀葵基因組DNA，PCR擴增ITS2片段，雙向測序，應用Mega6.0軟件分析序列，計算種內及種間遺傳距離，構建NJ鑒別樹。結果：蜀葵ITS2序列長度為233 bp，與藥蜀葵231～232 bp存在差異；蜀葵種內最大K2P遺傳距離為0.004，藥蜀葵種內K2P遺傳距離為0，蜀葵與藥蜀葵種間平均K2P遺傳距離為0.0732；NJ樹結果表明蜀葵與藥蜀葵均單獨聚為一支。結論：ITS2序列可用于維吾爾藥材蜀葵真偽鑒定的DNA條形碼，為保障臨床正確用藥提供了新的方法。

ITS2；蜀葵；鑒定

錦葵科(Malvaceae)蜀葵屬植物在我國分布有3種，其中蜀葵Althaearosea與藥蜀葵Althaeaofficinalis在新疆分布較為廣泛，而裸花蜀葵Althaeanudiflora分布較少[1-2]。

蜀葵及藥蜀葵皆為維吾爾醫常用藥，但功效用法不同。蜀葵：花可鎮靜安神、止咳平喘，種子用于清熱解毒、利水通便，根則下乳、生肌[3-4]；藥蜀葵：葉外用可消瘡祛癰，根內服利尿止咳[5-6]。新疆藥材地方標準僅收載了蜀葵[7-8]。但市場上常因兩者外觀相似而混淆[9]，存在臨床用藥安全隱患。因此，準確鑒定藥材基原，對保障藥材質量具有重要的意義。

DNA條形碼是利用植物基因組中一段通用標準短序列來進行物種鑒定的分子診斷新技術[10]，可不受樣品形態形狀的限制，實現快速、準確的判定植物基源。陳士林等研究證明ITS2序列可以作為通用DNA條形碼鑒別藥用植物[11-15]，已在羌活[16]、阿魏[17]、金銀花[18]、香青蘭[19]等中藥民族藥材得到驗證。“中藥材DNA分子鑒定指導原則”已載入《中華人民共和國藥典》2010版第三增補本[20]和2015版[21]。本文旨在研究蜀葵屬ITS2序列，建立蜀葵、藥蜀葵藥材基原的鑒定方法，保障患者用藥的準確與安全，為正確合理利用維吾爾藥材資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究樣本34個(詳見表1)。其中：11份采自新疆各地，由新疆中藥民族藥研究所副研究員王果平鑒定為蜀葵8份，藥蜀葵3份，憑證標本保存于新疆中藥民族藥研究所標本館(新疆XTNM)；購自維吾爾藥市場蜀葵藥材樣品6份；查自GenBank數據庫蜀葵序列10條，藥蜀葵序列5條，歐亞花葵序列2條。

表1 研究樣本信息

注：標本號為654021120704002、65230736的樣本ITS2序列與KF454359一致，H0228序列與KF454364一致。

1.1.2 試劑 PCR擴增引物由生工生物工程合成，ITS2正向序列：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生物。

1.1.3 實驗儀器 研磨儀：型號GT-100，GRINDER；離心機：型號Anker TGL-16C，上海安亭科學儀器；PCR擴增儀：型號070-851，An Analytik Jena company。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測 稱取干燥藥材30 mg，DNA提取研磨儀1000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量。

1.2.2 PCR擴增及測序 反應體積25 μL，dNTP 0.4 μL(10 mmol·L-1)，PCR緩沖液2.5 μL(10×)，引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)，聚合酶1.0 U，總DNA 1 μL(約30 ng)。引物ITS2擴增程序：94 ℃，變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(40個循環)；72 ℃延伸10 min[13]。PCR擴增產物電泳檢測后，使用ABI 3730 XL(Applied Biosystems Co.，USA)測序儀由美吉生物測序公司進行雙向測序。

1.3 數據處理

測序峰圖用CodonCode Aligner V 4.0.4(CodonCode Co.，USA)校對拼接，去除引物區。將所有序列由軟件MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)分析比對[22]，ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區段獲得ITS2間隔區序列[23]，用鄰接(NJ)構建系統聚類樹，使用bootstrap(1000次重復)檢驗各分支的支持率[24]。

2 結果與分析

2.1 DNA提取、PCR擴增及測序結果

從樣品葉片、干燥花、種子、根等藥用部位中均成功提取了基因組DNA，經電泳檢測條帶清晰，PCR結果經雙向測序，質量較好。

2.2 序列信息及變異

蜀葵24條ITS2序列比對后，長度均為233 bp。其中來源于基原植物標本的8條ITS2序列種內無變異位點，為1個單倍型，來源于藥材市場的蜀葵藥材有兩個單倍型，編號為YC000043的樣本在24 bp位點有C-個變異，其余樣本序列與蜀葵基原植物一致(如圖1)，來源于GenBank的序列均與基原植物相同。藥蜀葵8條序列比對后，長度為231～232 bp，KF454365在125 bp位點有T堿基缺失變異，其余序列與KF454364一致。蜀葵平均GC含量為53.22%，藥蜀葵為57.76%，蜀葵與藥蜀葵種間GC含量差異顯著。

圖1 不同單倍型實驗樣本種內及種間變異位點比較

2.3 種內及種間K2P距離分析

蜀葵種內K2P距離為0～0.004，平均K2P距離為0.000 3；藥蜀葵種內K2P距離為0。 蜀葵與藥蜀葵種間K2P距離為0.073～0.078，種間平均K2P距離為0.073 2，表2。ITS2序列種間存在18個變異位點，其中信息變異位點有16個，16個信息變異微店均以將蜀葵與藥蜀葵進行區分。

表2 種內種間K2P遺傳距離計算結果

2.4 蜀葵與藥蜀葵NJ樹聚類鑒定結果

采用蜀葵23條ITS2序列，藥蜀葵7條ITS2序列，以與蜀葵屬親緣關系相近形態相似的植物歐亞花葵作為外緣種構建NJ系統聚類樹，根據圖1可以看出，所有來源的蜀葵序列聚為一支，支持率為99%；藥蜀葵單獨聚為一支，支持率為99%。歐亞花葵作為外緣種，與前兩者顯著區分。因此，ITS2序列作為條形碼可準確鑒別維吾爾藥材蜀葵與藥蜀葵。

圖2 基于ITS2序列的單倍型NJ鑒別樹，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1000次重復)

3 討論

3.1 ITS2序列能夠準確穩定的鑒定維吾爾藥材

蜀葵與藥蜀葵為功效不同的兩種維吾爾常用藥材，但兩者存在混用現象[9]。本研究采用DNA條形碼ITS2序列對維吾爾藥材蜀葵、藥蜀葵進行鑒定，研究結果表明，藥用部位葉片、花、種子、根等藥用部位都能成功提取基因組DNA，適合應用DNA條形碼ITS2序列進行鑒定。通過對市場收集的6份蜀葵藥材進行鑒定，ITS2序列比對及NJ鑒別樹結果表明，不同地區收集的6份藥材均來源于蜀葵。本研究結果僅包括了6份市售藥材，不能代表市場上流通的所有藥材蜀葵，但DNA條形碼技術能準確鑒定市售藥材蜀葵的基原，為藥材的質量控制提供科學依據。

3.2 DNA條形碼在維吾爾藥材鑒定中的意義

藥材基原的準確性與中藥材的準確鑒定對中藥材的臨床療效有著重要的作用。相比中藥材，維吾爾藥材來源更為復雜，廣泛使用進口藥材，在長期的用藥過程中由于翻譯錯誤、鑒定錯誤、代用混用等原因，考證難度較大，傳統的形態、顯微、化學等鑒定方法雖然在藥材的鑒別中發揮了一定的作用，但對于鑒定近緣種和外觀形態相似的藥材，還存在一定的困難，加之藥材形狀易受到采收加工及儲存條件的影響，傳統鑒定方法已無法滿足藥材的鑒定需要[25]。相比之下，DNA條形碼鑒定不受藥材形狀影響，不受專業技術的限制，直接從基因水平提供鑒定依據。已有研究者采用DNA條形碼技術對來源與不同地區藥材市場的紅景天[26]、澤瀉[27]、鹿茸[28]、川木香[29]等中藥材進行了鑒定分析，結果表明DNA條形碼技術不僅可以為這幾種藥材市場真偽品現狀提供依據，而且可以追溯藥材的基原。因此，采用DNA條形碼技術可以快速準確的鑒定維吾爾藥材，在今后藥材來源、標準制定、藥材流通和市場管理等實際應用中具有重要的價值。

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IdentificationofUyghurMedicineAlthaearoseaandItsCloselyRelatedSpeciesBasedonITS2Sequence

FAN Congzhao，KUNDUZI·Ayi，LI Xiaojin*

(XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，Urumqi830002，China)

Objective：To explore a new method to identify Uygur MedicineAlthaearoseaand its closely related speciesA.officinalisby the difference of ITS2 regions.Methods：Genomic DNA ofA.roseaandA.officinaliswere extracted by Reagent kit，ITS2 sequences were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.Mega 6.0 software was used to analyze sequence，calculate intra- and inter-specific genetic distance and construct neighbor joining (NJ) tree.Results：The ITS2 sequence length ofA.roseawas 233 bp andA.officinaliswas 231 to 232 bp differences.The maximum K2P genetic distance ofA.roseawas 0.004，whenA.officinaliswas zero.The average interspecific K2P genetic distance betweenA.roseaandAlthaeaofficinaliswas 0.0732.NJ tree results showed thatA.roseaandA.officinaliswere clustered，respectively.Conclusion：The ITS2 sequences can be used to identify UygurA.roseawithA.officinalisas an effective DNA barcoding，which provides a new methods to ensure its clinical safety.

ITS2；Althaearosea；identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.004

2016-01-15)

新疆維吾爾自治區科技廳高新技術研究發展項目(201517107)

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李曉瑾，研究員，研究方向：中藥資源，Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com