基于一測多評法評價天麻活性成分的質量控制方法

唐爽，包永睿，2，3，孟憲生，2，3 *，富力，王帥，2，3

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600；4.大連富生天然藥物開發有限公司，遼寧 大連 116600)

基于一測多評法評價天麻活性成分的質量控制方法

唐爽1，包永睿1，2，3，孟憲生1，2，3 *，富力4 *，王帥1，2，3

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連116600；4.大連富生天然藥物開發有限公司，遼寧 大連116600)

目的：采用一測多評技術建立不同產地天麻活性成分的質量控制方法，為更加全面提升天麻質量控制方法提供依據。方法：采用高效液相色譜法，以天麻素為內標物，建立其與腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A的相對校正因子，對10種不同產地天麻的總苷進行含量測定。結果：采用相對校正因子法對10種不同產地天麻活性成分含量值進行計算，將計算值與外標法的實測值進行比較，二者無統計學差異。結論：采用一測多評法測定10種不同產地天麻中活性成分的含量，該方法為天麻藥材的品質優劣鑒定提供依據，為全面提升天麻藥材的質量提供新方法。

天麻；天麻活性成分；一測多評；質量控制

天麻為蘭科天麻屬植物天麻GastrodiaelataB1.的干燥塊莖，味甘，性平，歸肝經，其功效為熄風止痙。主產于我國云南、貴州、四川、陜西等地，有野生和種植之分，被列為常用名貴中藥。中藥材市場上天麻魚目混珠，有關天麻藥材質量控制方法的研究已有一些報道，《中華人民共和國藥典》及部分文獻對天麻的質量控制方法較為簡單，僅測定了天麻素的含量，在對中藥進行質量評價時，選擇單一成分存在很多不足，并且大部分文獻多以天麻整體藥材為研究對象，某些含量不高的有效成分無法測定，不能夠全面反應中藥材質量。天麻在藥理上有鎮痛、鎮靜、增加血流量、減少血管阻力、改善供血等作用，還具有抗氧化及細胞保護、益智健腦、延緩衰老的作用。其中腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A 均具有抗血小板聚集作用，故對天麻的活性成分進行提取、富集，得到純度較高的天麻活性成分，同時采用一測多評技術[1]同時測定天麻活性成分中腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A 5種成分的含量，該方法簡便、可行，為天麻藥材的質量控制規范及標準制定奠定實驗基礎。本文收集10種不同產地天麻藥材，包括道地及野生，對10種不同產地天麻活性成分的含量進行測定，方法可行，為天麻藥材的品質優劣鑒定提供依據，為中藥有效組分的質量控制提供新方法[2-3]。

1 儀器與材料

1.1主要儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；CP225D電子分析天平(德國Sartorius分析天平有限公司，十萬分之一)；MiLLi-Q超純水處理裝置(美國Millipore公司)；CO2培養箱(德國NUAIRE公司)；AE31型倒置相差顯微鏡(Motic公司)；SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2主要試藥

天麻藥材購自安國藥材批發市場，產地分別為安徽、遼寧丹東、貴州、河北、遼寧鳳城、湖北、吉林、遼寧本溪、四川、云南麗江(野生)。天麻素對照品(批號：110807-201306)、腺苷對照品(批號：110807-201308)均購于中國食品藥品檢定研究院；對羥基苯甲醇對照品(批號：130712)、對羥基苯甲醛對照品(批號：140301)、巴利森苷A對照品(批號：140320)均購于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈(色譜級，美國Fisher公司)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1混合對照品溶液的制備

分別稱取腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1mL含腺苷0.116mg、天麻素1.080mg、對羥基苯甲醇0.100mg、對羥基苯甲醛0.010mg、巴利森苷A3.266mg的對照品溶液，搖勻，即得[4-5]。

2.2供試品溶液的制備

取天麻藥材約5g，粉碎(過40目篩)，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入50mL70%乙醇，回流提取3次，每次1h，過濾，濾液濃縮至10mL，上AB-8樹脂柱(10g)，用10mL蒸餾水除雜，再用50mL90%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉移定容至10mL量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液即得[6]。

2.3色譜條件

AglientTC-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.04%甲酸水溶液，梯度洗脫(0→3→10→12→30→60min，2%→2%→8%→9%→9%→30%乙腈)；檢測波長：270nm；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：5μL[7-8]。色譜圖見圖1、2。

注：1.腺苷；2.天麻素；4.對羥基苯甲醇；8.對羥基苯甲醛；11.巴利森苷A；下同。圖1 天麻供試品HPLC色譜圖

圖2 對照品HPLC色譜圖

2.4方法學考察

2.4.1線性范圍考察 精密吸取上述混和對照品溶液1、3、5、10、14、18μL，注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得各對照品的線性回歸方程，結果見表1。表明各化合物在相應范圍內線性關系良好。

表1 各被測成分的線性回歸分析結果

2.4.2 精密度試驗 吸取混合對照品溶液5 μL，按上述色譜條件分析，連續進樣6次，記錄各色譜峰的峰面積，結果測得腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A峰面積值的RSD分別為0.79、1.03、1.83、2.50、1.08%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進樣，測定各指標性成分峰面積，結果測得腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A峰面積值的RSD分別為0.94%、1.10%、2.87%、2.02%、1.98%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別測定各指標性成分峰面積，按外標法計算樣品含量，結果測得腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A含量分別為0.177、4.330、0.112、0.026、9.754 mg·g-1，其RSD分別為1.47%、1.32%、1.26%、2.88%、0.97%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取天麻樣品2.5 g，共6份，分別精密加入腺苷0.225 mg·mL-1、天麻素5.25 mg·mL-1、對羥基苯甲醇0.076 mg·mL-1、對羥基苯甲醛0.027 mg·mL-1、巴利森苷A12.005 mg·mL-1混合對照品2 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按上述方法測定樣品含量，計算加樣回收率。結果腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A的平均加樣回收率分別為99.07%、98.10%、98.81%、100.00%、98.51%，RSD分別為0.82%、1.21%、1.07%、2.34%、0.95%，結果表明該方法法具有良好的回收率。

2.5相對校正因子的計算

在標準曲線Y=aX+b中，由于b值通常為誤差引起，在a/b值大于100時，b/a值可以忽略不計，此時可以X=Y/a直接計算，故相對校正因子(fk/s)可以用二者的斜率a之比來直接計算，相對校正因子計算公式為：fk/s=(ak/as)，即可以參照物快速推算其余待測化學成分的含量，計算公式為：Ck=Ak/(as×fk/s)。式中 as為參照物斜率，ak為待測組分對照品斜率，Ck為待測組分濃度，Ak為待測組分峰面積[9-10]。結果腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A的fk/s分別為9.208、2.634、44.654、0.476。見表2。

表2 天麻中4種成分的相對校正因子的計算

2.6相對校正因子重現性考察

本試驗考察2套色譜系統(Agilent1100和Waters2695)以及不同色譜柱(AglientTC-C18和PhenomenexLunaC18)對相對校正因子的影響，表2結果顯示各成分的相對校正因子RSD≤2.17%。表明各成分的相對校正因子重復性良好。

2.7一測多評法與常規法測定結果的比較

分別取10批不同產地的天麻藥材粉末各5g，精密稱定，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣測定，再分別用外標法和一測多評法計算10批不同產地天麻中5種成分的含量，見表3。結果經t檢驗及person相關分析證明2種方法結果無統計學差異，可見一測多評在天麻的多指標成分質量評價中應用是可行的。由數據可知天麻活性成分中天麻素含量為0.594～4.364 mg·g-1、腺苷含量為0.178～0.397 mg·g-1、對羥基苯甲醇含量為0.038～0.648 mg·g-1、對羥基苯甲醛含量為0.006～0.034 mg·g-1、巴利森苷A含量為7.024～14.345 mg·g-1。以上5種成分均與血小板作用密切相關，因此可通過進一步的藥效實驗來制定天麻活性成分中該5種成分的定量標準。

表3 天麻中4種成分含量測定結果 /mg·g-1

3 討論

中藥的質量控制研究是中藥研究的重要部分，在天麻的質量控制研究中，在以往文獻中多以天麻整體藥材為研究對象，某些含量不高的有效成分無法測定，相關研究表明其主要的化學活性成分為天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等成分，故本文以組分中藥為出發點，在前期的組分富集基礎上，對純度較高的天麻活性成分進行質量控制，該方法為現代化進程中新藥研發和中藥質量標準提供研究思路及研究路線。

天麻屬名貴中藥材，分布遍及全國各地，分為野生和栽培，道地主產區有貴州、四川，同時安徽產地在市場流通中占據很大一部分，但其偽品也有很多，優劣難辨，嚴重影響天麻藥材的質量，故本文收集10種不同產地的天麻(包括道地、市場流通較多及野生品種)，建立其質量控制方法，該方法可行，為天麻藥材的品質優劣鑒定提供依據，有效評價天麻藥材的安全性和有效性，從而建立更加全面的質量標準。

本文采用QAMS技術實現對天麻中5種有效化學成分同時段進行多指標含量測定，一測多評技術的研究思路側重從量上闡明主要成分或藥效成分間的相互關系，多用于同類型或同系列化合物，因為該類化合物測定波長基本一致，即使換不同儀器其重現性也較好。一測多評技術更是解決中藥對照品難以分離或性質不穩定、易分解等一系列問題。相對校正因子的運用能夠實現在對照品短缺或特別昂貴情況下的多指標成分含量測定。天麻中對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷A對照品價格較貴，而采用本文方法，僅以價格便宜的天麻素對照品即可實現天麻中多指標成分定量，即以一個內參對照品控制多個與藥效相關的化學成分，其測定方法具有一定應用價值。

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StudyonQAMSMethodforQualityControlofTotalGlycosidesinGastrodiaElata

TANGShuang1，BAOYongrui1，2，3，MENGXiansheng1，2，3*，FULi4*，WANGShuai1，2，3

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.Liaoningprovincemulti-componentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchandEngineeringLaboratory，Dalian116600，China；4.DalianFushengNaturalDrugDevelopmentCo，Ltd，Dalian116600，China)

Objective：To establish a quality control method of the active ingredients inGastrodiaelatafrom10batches by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) technology and provide the basis for more comprehensively improving the quality control method ofG.elata.Methods：The HPLC was adopted for establishing the relative correction factors between gastrodin used as internal standard and adenosine，p-hydroxybenzyl alcohol，p-hydroxybenzaldehyde and parishin A，and then determined the contents of multiple components.Results：Using relative correction factor method for10different origins ofG.elataactive ingredients content value calculation，the calculated value compared with measured values，there was no significant difference.Conclusion：The QAMS is feasible and accurate to evaluate the contents of the active ingredients ofG.elatafrom10batches，the method provide the basis for quality identification ofG.elataand a new way to improve Chinese traditional medicine quality control standards.

Gastrodiaelata；active ingredients ofGastrodiaelata；QAMS method；quality control

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.011

2015-10-22)

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孟憲生，教授，博士生導師，研究方向：中藥藥效物質和作用機制，Tel：(0411)85890185，E-mail：mxsvvv@126.com；富力，博士，教授級高級工程師，研究方向：天然產物化學，Tel：(0411)39962699，E-mail：2729677386@ qq.com