花粉形態數量化分析在忍冬屬花類藥材的鑒別及分類中的應用△

李群，吳和珍，*，田代志，胡志剛，3

(1.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；2.湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430065；3.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700)

花粉形態數量化分析在忍冬屬花類藥材的鑒別及分類中的應用△

李群1，吳和珍1，2*，田代志2，胡志剛1，3

(1.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢430065；2.湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢430065；3.中國中醫科學院 中藥研究所，北京100700)

目的：對忍冬屬不同產地12個樣本的花粉形態進行系統觀察，以期在表觀性狀比較的基礎上，為忍冬屬花類藥材的鑒別及分類提供依據。方法：利用掃描電鏡(SEM)觀察花粉形態、表面紋理，測量花粉表面刺突的大小和密度；利用光學顯微鏡測量花粉的大小，獲得花粉形態特征數據，并用SPSS20.0軟件進行分析。結果：忍冬屬同種不同產地的花粉形態數量化特征大體相近，但種間的花粉特征均有一定差異。結論：將花粉形態數量化并結合統計學分析可為忍冬屬花類藥材的鑒別和分類提供參考依據。

忍冬屬；花粉形態數量化；SPSS20.0軟件；掃描電鏡；光學顯微鏡

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]，為臨床常用中藥。市場上金銀花的偽品較多，絕大部分為山銀花或同屬其他植物的花蕾。傳統鑒別方法主要依靠形態分類學和解剖學特征進行藥材的真偽鑒別，然而對于忍冬屬同屬多種花類藥材，其表面特征極其相似，且同種藥材因產地不同也會發生變異，使該方法的應用存在局限性。

花粉在遺傳學上具有較強的保守性和穩定性，不同植物的花粉形態獨特、表面紋理細微特殊，常被用作植物分類和藥材鑒別的重要依據。尤其隨著掃描電鏡的出現和推廣，借助花粉形態研究植物分類和藥材鑒別的報道日益增多。張元明[2]利用花粉形態結合統計分析研究中國檉柳科4屬27種植物，驗證傳統分類的可靠性；早期朱雅東等[3]用光學顯微和掃描電鏡對忍冬屬19種藥用金銀花的花粉形態進行研究。但迄今為止，未見采用花粉形態數量化-聚類分析方法鑒別忍冬屬的花類藥材并為分類提供依據的報道。

本文以忍冬屬12個樣本為代表，運用掃描電鏡、光學顯微鏡對其花粉形態特征進行觀察比較，并進行統計學分析，探討數量化-聚類分析模式在忍冬屬花類藥材的鑒別及分類中的應用。

1 儀器與材料

1.1儀器

ModelUB100iSeries生物顯微鏡(重慶澳浦光電技術有限公司)，JEOLJFC-1600AUTOFINECOATER離子濺鍍機(日本電子株式會社)，JEOLJSM-6510LV掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.2材料

12個樣本由中國醫學科學院藥用植物研究所提供，由研究所陳士林團隊做過DNABarcoding鑒別研究[4]，見表1。

表1 忍冬屬12個樣本材料來源

2 方法

2.1光學顯微法測定花粉大小

每個樣本取2～3個花藥在載玻片上用鑷子輕輕碾碎，水合氯醛透化裝片，Model UB100i Series生物顯微鏡下觀察。隨機各選取30粒花粉，顯微測微尺測量其極軸長(P)和赤道寬(E)。P×E 表征花粉大小，P/E表征花粉形狀。

2.2掃描電鏡法觀察花粉表面特征

將用于掃描電鏡觀察的花蕾置于干燥器中干燥，輕輕將干燥花粉均勻涂于粘有雙面膠帶的鋁金屬樣品臺上，用JEOL JFC-1600AUTO FINE COATER 噴金后，在 JEOL JSM-6510LV型掃描電子顯微鏡下觀察花粉的形狀、萌發孔、表面紋理等特征，并攝像。隨機選取攝像清晰且是正面的10粒花粉，分別測花粉邊緣直立的刺突的長度(L)和正面刺突的基部直徑(Dia)，每粒測2個數據；隨機選取20粒花粉，在放大1500倍情況下，每粒測熒屏上每(3×3) cm2表面[即花粉粒表面中部每(15×15) μm2)]所分布的刺突數，衡量花粉表面刺突的密度(D)。

2.3數據分析

將極軸長(P)、赤道寬(E)、P/E、刺突的長度(L)、刺突的基部直徑(Dia)、刺突的密度(D)作為觀察指標進行統計學分析。但由于有的變量之間存在相互關聯，用SPSS20.0軟件先對這些指標進行主成分分析，組合出互不關聯的綜合指標，然后對綜合指標聚類分析，按計算結果畫出聚類分析圖。

3 結果與分析

3.1掃描電鏡觀察結果

12個樣本的花粉形狀很相似，近扁球形至近球形；極面觀均近似三角形，赤道面觀橢圓或近圓形；萌發孔3個，均為橢圓形；表面具刺狀突起。但花粉粒的大小(極軸長、赤道面寬)，表面刺突的長短、粗細、疏密都存在差異，觀察結果見表2。花粉的極面、赤道面、表面刺突、萌發孔的電鏡掃描圖見圖1。

表2 忍冬屬12個樣本的花粉形態特征數據表

3.2數據分析

3.2.1數據標準化處理和主成分分析 主成分分析是一種降維或者將多個指標轉化為幾個綜合指標的多元數理統計方法[5-6]。實驗選擇的指標之間往往互有影響，需要將這些指標進行主成分分析，選出幾個互不關聯的綜合性指標來反映原來的指標的信息；由于各指標具有不同的量綱，因此在主成分分析前先將數據標準化，使數據具有可比性。表2中的數據標準化后如表3所示，主成分分析內容見表4～6。

表3 忍冬屬12個樣本6個花粉形態特征指標數據標準化結果

表4 6個主成分的特征值以及貢獻率

由表4可知前3個主成分的累積貢獻率達到92.394%，能充分反映原始數據的信息，故選取前3個主成分分析。

表5 主成分載荷矩陣

表6 主成分得分

3.2.2 聚類分析 采用表6中主成分得分代替原始指標對樣本進行聚類分析，從而達到降維和綜合指標的作用。聚類分析結果見圖2。

圖2 12個樣本聚類分析結果

從圖2看出，在聚類重新標定距離(rescaled distance cluster combine，RDCC)約為3時，樣本5、6聚成一類A，樣本2、3聚為一類B，樣本8、9聚為一類C，樣本10、12聚為一類D，樣本7自成一類E，大致與DNA Barcoding 結果相符，但仍存在個別差異。如：在DNA Barcoding鑒定中被歸于B類的樣本1在RDCC 為3以下時歸為C類，但其花粉粒大小卻與歸于C類的樣本8、9相差懸殊，在RDCC約為5時B類、C類又可聚為同一類，可能揭示原植物種間遺傳距離相近；按DNA鑒定結果，樣本4與樣本5、6同種，樣本11與樣本10、12同種，與此處聚類分析結果不符，但觀察花的外觀形態可知，樣本4和樣本11與各自同種的其他樣本的花在外觀上就明顯不同，聚類結果支持了外觀上的差異，結合各自的產區，揭示種內花粉的這種形態上的差異可能與不同生態環境下的變異或營養狀況有關。

基于外觀上的比較分析，花粉特征聚類分析結果總體上支持形態學和遺傳學分類的結果，可用于忍冬屬花類藥材的鑒別及分類。

4 討論

我國忍冬屬植物資源非常豐富，野生和栽培品種繁多[7]。在長期演化過程中，植物器官的形態很多產生了變異，使植物的鑒別、分類產生困難。但花粉在長期進化過程中基因相對保守，受環境影響較小[8]，形態特征較穩定，因此可為植物的起源、演化、分類和鑒定提供依據[9-10]。

本文研究結果表明，不同產地的忍冬屬花粉形態特征很相近，體現忍冬屬植物的共同特征；但不同種或同種不同產地的植株的花粉大小、表面刺突長短、疏密等存在一定差異，將這些差異特征數量化分類，分類結果與形態學、遺傳學分類結果大體一致，一定程度上既反映了種內花粉的共性，又可體現種間的差異性，對于鑒別不同種藥材具有重要的價值。對于不斷進化、不斷變異的忍冬屬植物來說，數量化分類的方法雖然未能完全地確定其分類學地位，但該種分類方法必將在今后自然科學分類和藥材的鑒定中得到完善和發展。

《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2005版將金銀花和山銀花分成2種藥材收載，金銀花僅來源于忍冬科植物忍冬一個品種，山銀花來源于灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬[11]，《中國藥典》2010版山銀花品種又新收載黃褐毛忍冬[1]28，而且還有增加趨勢。本研究中，樣本1與樣本2、3，樣本4與樣本5、6分別被遺傳學鑒定為同一個種，但由于產區不同，同種的花粉形態地域差異性明顯，引發了一個關于地區藥材分類的思考：能否依據這種地域性差異將某物種從傳統分類中劃分出來，歸入他類或自成一類；《中國藥典》上收載的金銀花、山銀花的來源是否要有地區上的限定；樣本11所代表的一類細氈毛忍冬的花能否被新收入作山銀花的品種，這類問題都有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：28，221.

[2] 張元明.中國檉柳科植物花粉形態特征聚類分析[J].西北植物學報，2004，24(9)：1702-1707.

[3] 朱雅東，濮祖茂，徐國鈞，等.中藥金銀花花粉形態研究[J].中國藥科大學學報，1987，18(2)：81-88.

[4]SunZ，GaoT，YaoH，etal.IdentificationofLonicerajaponicaand its related species using the DNA Barcoding method[J].Planta Med，2011，77：301-306.

[5] 張玉榮，張秀華，周顯青，等.主成分分析法綜合評價大米的食味品質[J].河南工業大學學報，2008，29(5)：1-5.

[6] 宋江峰，李大婧，劉春泉，等.甜糯玉米軟罐頭主要揮發性物質主成分分析和聚類分析[J].中國農業科學，2010，43(10)：2122-2131.

[7] 張芳，張永清，周鳳琴，等.忍冬5個農家品種花粉形態比較觀察[J].中國中藥雜志，2011，36(10)：1266-1268.

[8] 孫崇波，向林，施季森，等.蘭科5屬常見栽培品種花粉塊形態的掃描電鏡觀察[J].園藝學報，2010，37(12)：1969-1974.

[9] 孫佳，曾麗，劉正宇，等.微型月季品種分類的花粉形態學[J].中國農業科學，2009，42(5)：1867-1874.

[10] 顧欣，張延龍，牛立新.中國西部四省15種野生百合花粉形態研究[J].園藝學報，2013，40(7)：1389-1398.

[11] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化學工業出版社，2005：21.

ApplicationofNumericalTaxonomyofPollenMorphologyinPharmacognosticIdentificationandClassificationofLoniceraL.

LIQun1，WUHezhen1，2*，TIANDaizhi2，HUZhigang1，3

(1.CollegeofPharmacy，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.KeyLaboratoryofMinistryofeducationofResourcesoftraditionalChinesemedicineandChineseherbalcompound，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；3.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To make systemic morphological observation for12pollen samples ofLoniceraL.from different habitats and provide a reference for pharmacognostic identification and classification based on the character comparisons.Methods：The scanning electron microscope (SEM) was applied to observe the morphological characteristics and gauge the size and density of external spine while the pollen size was measured by means of optical microscope，and the data were analyzed by SPSS20.0software.Results：Numerical features of pollens of same species from different habitats were broadly similar in contrast with interspecific differences.Conclusion：Application of Numerical Taxonomy of Pollen Morphology combined with statistical analysis can provide a basis for pharmacognostic identification and classification ofLonicera.

LoniceraL.；numerical taxonomy of pollen morphology；SPSS20.0software；scanning electron microscope(SEM)；optical microscope

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.012

2015-11-03)

湖北省教育廳2010年度高校產學研合作資助項目(C2010042)

*

吳和珍，教授，博士生導師，研究方向：中藥品種、質量及其資源開發研究；E-mail：hezh_wu@163.com