正交設計優選蛹草擬青霉中蟲草素和蟲草多糖的提取工藝△

黃婷婷，馬云淑，陽丹，王維麗，譚麒冉

(云南中醫學院 藥學院，云南 昆明 650500)

正交設計優選蛹草擬青霉中蟲草素和蟲草多糖的提取工藝△

黃婷婷，馬云淑*，陽丹，王維麗，譚麒冉

(云南中醫學院 藥學院，云南 昆明 650500)

目的：采用正交設計優化蛹草擬青霉菌絲體中蟲草素和蟲草多糖的提取工藝。方法：建立高效液相色譜測定指標成分蟲草素含量的方法，采用正交試驗法考察醇濃度、加醇量、提取次數與時間的組合3個因素對蟲草素乙醇提取率的影響。醇提后殘渣以水提取多糖，采用苯酚-濃硫酸比色法在490 nm處測定蟲草多糖的含量，以單因素法篩選多糖提取工藝。結果：HPLC色譜條件下精密度的RSD為0.30%，穩定性的RSD為1.27%，重復性的RSD為2.93%。以乙醇濃度為90%，加醇量為10倍量，提取3次，每次1 h蟲草素的提取率最高；而以乙醇濃度為95%，加醇量為6倍量，提取3次，每次1 h提取蟲草素后的殘渣再以水提取，蟲草多糖得率最高。結論：所優化的提取工藝蟲草素和蟲草多糖提取率均較高，采用的含量測定方法穩定可靠。

蛹草擬青霉菌絲體；正交試驗；蟲草素；蟲草多糖；高效液相色譜法

蛹草擬青霉(PaecilomycesmilitarisLiangsp.nov.)是從蛹蟲草Cordycepsmilltaris(ex Fr)Link中分離而得的一種真菌，現多用作蛹蟲草的代用品。梁宗琦[1]通過人工培養的成熟子實體無性型菌株的形態學和生物學結果，將蛹蟲草無性型鑒定為擬青霉屬的一種新種。蛹蟲草又稱為北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草、東北蟲草[2]，其主要含有蟲草多糖、蟲草酸(D-甘露醇)、氨基酸、超氧化物歧化酶(SOD)活酶以及蟲草素等核苷類成分[3]。研究發現，蛹草擬青霉菌絲體中也含有核苷、蟲草素、多糖等多種生物活性物質[4]。其中蟲草素具有抑制炎癥發生、細胞增殖、遷移、入侵和腫瘤發生等功能[5]；蟲草多糖具有調節免疫力、抗腫瘤、保護肝臟和腎臟、降血糖、降血脂等藥理作用[6]。目前報道二者有關提取技術的研究對象大都為蛹蟲草[7-11]，針對蛹草擬青霉菌絲體中的蟲草素和多糖的提取工藝研究較少。為提高蛹草擬青霉菌絲體的利用率，本文采用乙醇作為提取溶劑，優選蛹草擬青霉菌絲體中蟲草素提取工藝，并考察不同正交工藝條件下乙醇提取蟲草素后，菌絲體殘渣中水提取蟲草多糖的提取率。同時建立HPLC法檢測蟲草素含量，紫外分光光度計測定蟲草多糖含量的方法，為充分合理開發利用蛹草擬青霉菌絲體提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國Agilent1100 Series，四元泵、二極管陣列檢測器)；WFZ UV-2000紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；KMDOS-SK250HP超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)；電子分析天平(瑞士普利賽斯儀器公司，Xs25A，d=0.00 001 g)；Sartorius BT25S電子稱；HH-s數顯恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司)；TDL-5-A臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥

蟲草素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：858-200202)；葡聚糖(阿達瑪斯，批號：P1054729)；苯酚(汕頭市光華化學廠，批號：20030307)；娃哈哈純凈水；無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠，批號：20121105)；濃硫酸(云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司，批號：20101221)；95%乙醇(食用級)；甲醇(色譜純)。

蛹草擬青霉菌株來源于云南嵩明，由云南云百草生物有限公司培養提供。

2 方法與結果

2.1 蛹草擬青霉菌絲體中蟲草素與多糖的提取工藝考察

在預試驗基礎上，采用回流提取法，按照表1對醇濃度、加醇量、提取時間及次數的組合3個因素，按3水平進行正交試驗，考察醇提蟲草素的最優工藝條件，對醇提殘渣再以水提取蟲草多糖，考察提取率。

蟲草素提取：精密稱取SM5蛹草擬青霉菌絲體5.00 g，分別置于50 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇，振搖混合后，連接回流冷凝管。圓底燒瓶置于電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸，規定時間內停止加熱，趁熱抽濾。濾液揮干，稱重，計算醇提出膏率，并采用HPLC法測定蟲草素的含量。

蟲草多糖的提取：將上述經乙醇提取蟲草素后的蛹草擬青霉菌絲體殘渣加入8倍量水，熱回流提取3次，每次1 h，提取液過濾，濾液合并，揮干，稱重，計算水提出膏率，并采用紫外分光光度法(UV)測定多糖的含量。

表1 因素水平表

2.2 蟲草素的含量測定

2.2.1 HPLC法色譜條件 色譜柱：Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(14∶86)；流速：1.0 mL·min-1；UV檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在上述HPLC條件下，蟲草素分離較好，且溶劑峰對其無干擾。結果見圖1。

注：A.空白溶劑；B.蟲草素對照品；C.蛹草擬青霉菌絲體供試品。圖1 蛹草擬青霉菌絲體供試品及對照品HPLC圖

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取各正交試驗醇提物0.2 g，加入20%的甲醇提取液2 mL，超聲處理90 min，取出，4000 r·min-1離心15 min，用注射器吸取上清，過0.45 μm微孔濾膜，即為供試品溶液[4]。

2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取蟲草素2.06 mg，用20%甲醇定容至10 mL。精密移取溶液2.5 mL置于5 mL容量瓶中，定容，配得質量濃度為103 μg·mL-1的蟲草素對照品溶液。再移取103 μg·mL-1對照品溶液2.5 mL，定容至5 mL，重復操作，配成6份系列濃度的對照品溶液備用。

2.2.4 標準曲線的繪制 取6份系列濃度的對照品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進樣洗脫，并測定峰面積，以蟲草素對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)作線性圖，求回歸方程：Y=27.550X-14.821，r=1.000 0，在3.22～206 μg·mL-1蟲草素濃度與峰面積有良好線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取上述中間濃度(25.75 μg·mL-1)的蟲草素對照品溶液10 μL，按照2.2.1項下HPLC條件重復進樣6次，測定峰面積，蟲草素RSD為0.30%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一供試品6份，按2.2.2項下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.2.1”項下HPLC條件，測定蟲草素含量，結果RSD=2.93%。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h，按2.2.1項下色譜條件進樣，測定蟲草素峰面積，結果RSD=1.27%。

2.2.8 樣品含量測定 精密稱取各正交試驗醇提物，按2.2.2項下方法制成供試品溶液，分別精密吸取10 μL，按照2.2.1項下HPLC條件，測定供試品溶液中蟲草素的含量。

2.3 蟲草多糖含量測定(苯酚-硫酸法)

2.3.1 供試品溶液制備 對醇提工藝正交試驗殘渣再經水提所得的9份浸膏，分別精密稱取0.10 g，加入蒸餾水15 mL，加熱回流2 h后趁熱抽濾，用蒸餾水洗殘渣，將濾液、洗液合并，定容至25 mL。精密移取定容好的溶液20 mL，置于蒸發皿中水浴揮干。將揮發后剩余物用1 mL蒸餾水洗出，溶解，并置于10 mL離心管中，加入5 mL無水乙醇，混勻，4000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。沉淀物加蒸餾水、無水乙醇，離心過程再重復2次。取沉淀物用蒸餾水溶解定容至50 mL，作為樣品液備用。吸取2 mL樣品液至20 mL試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混勻，快速加入7 mL濃硫酸，混勻，置于40 ℃水浴30 min，再置于冰水浴5 min，之后快速升至室溫，用紫外分光光度計測定490 nm波長吸光度。以蒸餾水代替待測樣品溶液，用同樣方法操作，作為空白對照[4]。

2.3.2 標準曲線繪制 稱取分子量為4萬的葡聚糖0.050 0 g，定容至50 mL備用。分別取定容好的對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于100 mL容量瓶中定容。按2.3.1項下多糖測定方法進行操作。以蒸餾水為空白，在490 nm波長處分別測定各對照品的吸光度。以葡聚糖質量濃度為縱坐標、吸光度A為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.010 8X+0.032 9，r=0.999 3，吸光度在0.2～0.7與葡聚糖質量濃度具有良好的線性關系。

2.4結果

2.4.1 蟲草素的醇提工藝正交試驗結果 2.2.8中測定所得蟲草素含量見表2，蟲草素的醇提正交試驗結果極差分析見表3，方差分析見表4～5。

結果表明，對醇提出膏率A、B、C因素影響差異不具有統計學意義，影響程度為A>C>B，即醇濃度>提取時間與次數>加醇倍數，最佳工藝條件為A2B3C3，即乙醇濃度為90%，每次10倍量，提取3次，每次1 h。對蟲草素提取率A因素即醇濃度影響具有統計學意義(F0.05B>C，即醇濃度>加醇倍數>提取時間與次數，最佳工藝條件為A2B3C3，因此確定蟲草素提取最佳工藝條件為乙醇濃度為90%，每次10倍量，提取3次，每次1 h。

表2 正交試驗結果

表3 醇提工藝正交試驗出膏率與蟲草素含量極差分析

表4 醇提出膏率提取率方差分析

注：“-”表示無顯著性。下同。

表5 醇提蟲草素工藝提取率方差分析

注：“*”表示F>F0.1。

2.4.2 正交試驗后殘渣的水提多糖得率分析 將醇提后的殘渣揮干乙醇后用水提取，結果見表2，根據正交試驗結果進行多糖得率極差分析及方差分析，見表6～8。

表6 水提工藝出膏率與多糖得率極差分析

表7 水提工藝出膏率方差分析

表8 多糖提取工藝提取率方差分析

結果表明，對水提出膏率A、B、C因素影響差異均不具有統計學意義，影響程度為A>C>B，即醇濃度>提取時間與次數>加醇倍數，最佳工藝條件A2B1C3，即以90%乙醇，提取3次，每次6倍量，提取1 h。對多糖提取率A、B、C因素影響差異均不具有統計學意義，影響程度為B>A>C，即加醇倍數>醇濃度>提取時間與次數，最佳工藝條件為A1B1C3，即以95%乙醇提取3次，每次6倍量，提取1 h，該條件下提取出來的蟲草多糖含量較高。

綜合蟲草素與蟲草多糖的提取率試驗結果，當醇濃度為90%，每次10倍量，提取3次，每次1 h時蟲草素提取率高；而以95%乙醇，每次6倍量，提取3次，每次1 h時蟲草素醇提后的殘渣中蟲草多糖得率高。考慮到需在充分提取蟲草素基礎上，再利用殘渣提取較多的蟲草多糖，最終優選工藝為以90%乙醇，加醇量分別為10、8、6倍，提取3次，每次1 h，殘渣揮去乙醇后，分別加10、8倍量水提取2次，每次1.5 h。

2.5 工藝驗證

取蛹草擬青霉菌絲體5.00 g，分別用90%乙醇10、8、6倍量提取3次，每次1 h，趁熱過濾，收集乙醇提取液，減壓回收至無醇味，于40 ℃干燥后備用。將醇提后的藥渣揮至無醇味，再分別用10、8倍量的水提取2次，每次1.5 h，收集水提取液備用。

分別按2.2、2.3項下方法測定醇提浸膏中蟲草素含量和水提浸膏中蟲草多糖含量，結果見表9。

驗證試驗結果與正交試驗優選方案相比，蟲草素含量接近，蟲草多糖含量相對降低，穩定性較好，表明所選工藝條件穩定可行。

表9 工藝驗證結果

3 討論

本文首先考察了醇濃度、加醇量、提取時間及次數的組合3個因素對蛹草擬青霉中蟲草素的影響，進而考察醇提后殘渣中多糖提取率，為同時提取蟲草素與多糖提供試驗依據。結果顯示，乙醇濃度對菌絲體中蟲草素提取率影響明顯，同時也影響醇提后菌絲體殘渣中水提取多糖的得率。由于多糖不溶于高濃度乙醇，因此當乙醇濃度為95%時，殘渣中多糖得率最高，但與90%乙醇提取后殘渣中多糖得率差異無統計學意義。而蟲草素在90%乙醇中提取率最高，綜合考察蟲草素和多糖提取率，最終提取工藝確定為分別用90%乙醇10、8、6倍量提取3次，每次1 h，藥渣揮至無醇味后，分別用10、8倍量的水提取2次，每次1.5 h。

蟲草素主要溶于水、熱乙醇、甲醇，常用的提取方法有浸提法、超聲法、索氏提取法和回流提取法。本文采用回流提取法提取蛹草擬青霉菌絲體，并建立了蟲草素的HPLC條件。

經對比測定正交醇提部分和水提部分中蟲草素的含量發現，先用高濃度的乙醇提取蛹草擬青霉菌絲體，殘渣再經水提后，水提部分再測定蟲草素質量分數為6.99 μg·g-1，含量較低，即高濃度的乙醇可將蛹草擬青霉中的蟲草素基本提取完全。

一般蟲草多糖的提取工藝為水提液經適當濃縮，再用高濃度乙醇沉淀，得更純的多糖。但本文考慮到水提液中還含有其他有效成分，而蟲草多糖只作為正交工藝考察指標，故只將醇提殘渣水提后濃縮得到水提浸膏，工藝中未涉及到醇沉這一純化步驟。

[1] 梁宗琦.蛹蟲草無性型―蛹草擬青霉的確證[J].食用菌學報，2001，8(4)：28-32.

[2] 徐錦堂.中國藥用真菌學[M].北京：北京協和醫科大學，1997.

[3] 廖春麗，方改霞，王蓮哲，等.蛹蟲草主要有效成分分析[J].安徽農業科學，2008，36(12)：5050-5052

[4] 王百樂，虞泓，曾文波，等.滇中蛹草擬青霉活性成分分析[J].中國食用菌，2012，31(4)：57-61.

[5] 王銀銀.蟲草素的功效研究進展[J].中國科技產業，2012(5)：40-43.

[6] 余伯成，唐亮.蟲草多糖藥理學研究進展[J].世界科學技術—中醫藥現代化，2011，13(3)：585-590.

[7] 孫源.蛹蟲草多糖提取及其協同抗氧化作用分析[D].哈爾濱：東北林業大學，2013.

[8] 劉紅錦，蔣寧，李建軍，等.蛹蟲草多糖提取及純化工藝研究[J].江西農業學報，2007，19(12)：80-82.

[9] 譚放，張妍妍，王偉驍，等.蛹蟲草多糖提取的研究[J].中國林副特產，2009(4)：14-16.

[10] 鄭慶委，張濤，徐志本.水提法和微波助提法在蛹蟲草多糖提取中的應用[J].蚌埠醫學院學報，2011，36(11)：1263-1264.

[11] 占鵬飛，徐森華，施國方，等.蛹蟲草多糖提取及其免疫功能研究進展[J].蠶桑通報，2014(2)：10-14.

StudyonExtractionProcessofCordycepinandCordycepicPolysaccharidesfromMyceliaofPaecilomycesmilitarisbyOrthogonalDesign

HUANG Tingting，MAYunshu*，YANGDan，WANGWeili，TANQiran

(CollegeofPharmacy，YunNanUniversityofTraditionalMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To optimize the extraction processes of cordycepin and cordycepic polysaccharides from mycelia ofPaecilomycesmilitarisby using Orthogonal design.Methods：A HPLC method was established to determine the content of cordycepin which was taken as indexes，and orthogonal test method was used to investigate three factors of alcohol concentration，alcohol volume ratio，and the combination of extraction times with time to influence on the extraction efficiency of cordycepin.Detection was performed at wavelength of 260 nm.The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL.After extracted by alcohol，the residue of mycelia was dealt with water to extracted cordycepic polysaccharides，and colorimetric method by using phenol—concentrated sulfuric acid as chromogenic agent was used to determine the content of cordycepic polysaccharides in the extract under 490 nm.Results：Under the condition of HPLC，the precision of RSD was 0.30%，the stability of RSD was 1.27% and the RSD of reproducibility was 2.93%.The results showed the extract ratio of cordycepin was the highest with the process parameters of 90% alcohol，10 times of alcohol volume ratio，3 times with 1h for every time.And the water extract ratio of Cordyceps polysaccharide in the mycelia residue was the highest after cordycepin was extracted from mycelia with 95% alcohol，6 times of alcohol volume ratio，3 times，with 1h each time.Conclusion：The extraction efficiency of cordycepin and Cordyceps Polysaccharide was high under the optimum process，and the methods of the content determination were stabile and reliable.

Mycelia ofPaecilomycesmilitaris；orthogonal test；cordycepin；cordycepic polysaccharides；HPLC

2015-05-12)

云南省教育廳科學研究基金重大專項(00360320700)

*

馬云淑，教授，研究方向：中藥學；E-mail：yunshuma2@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.018