流動注射-化學發光法分析延胡索總生物堿△

朱海萍，史紅艷，王仕寶，楊培君

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001)

流動注射-化學發光法分析延胡索總生物堿△

朱海萍，史紅艷，王仕寶，楊培君*

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001)

目的：建立檢測中藥材延胡索總生物堿含量的流動注射-化學發光(CL-FIA)分析法。方法：在酸性環境中，基于延胡索總生物堿對Ce4+-Rhodamine B(羅丹明B)化學發光體系的強烈增強作用，篩選出Ce4+-羅丹明 B體系用于CL-FIA檢測延胡索總生物堿，并開展干擾試驗、方法學驗證以及HPLC檢測對比。結果：在優化條件下，體系的相對發光強度與延胡索總生物堿在0.014 24～0.227 84 μg·mL-1(r=0.996 4)呈良好的線性關系，檢出限為0.009 06 μg·mL-1，RSD=1.39%(n=11)；延胡索總生物堿平均得率為0.597%。結論：該方法分析速度快、成本低、靈敏度較高，為延胡索總生物堿的分析檢測提供了另一新途徑，具有實際的應用價值。

延胡索；流動注射；化學發光；生物堿；分析檢測

延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang，又名元胡，為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，是中醫臨床常用藥物之一，具活血、行氣、止痛之功效，用于胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛，經閉痛經，產后瘀阻，跌撲腫痛[1]。此外，對肝癌細胞、胃癌細胞、鼻咽癌細胞增殖均具有抑制作用[2-4]。現代研究表明其主要成分為生物堿類化合物[5]，目前關于延胡索生物堿中延胡索乙素的研究報道較多[6-12]。近年來，流動注射-化學發光法(CL-FIA)廣泛應用于藥品成分檢測[13-15，18-21]，植物活性成分的檢測也有報道[16]。本研究建立了一種分析檢測中藥材延胡索總生物堿的Ce4+-Rhodamine B(羅丹明B)體系的CL-FIA新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

延胡索塊莖于2014年6月采自陜西城固縣南樂種植基地。塊莖清洗后切片，60 ℃干燥，粉碎，過粒徑0.45 mm的篩，備用。

1.2 試劑與儀器

延胡索乙素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：YA0809YA13，純度≥98%)；

(NH4)4Ce(SO4)4(BR，上海金穗生物科技有限公司)；羅丹明B(分析純，上海金穗生物科技有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純；HNO3溶液(1.0 mol·L-1)、三乙胺(體積分數0.1%)、濃氨水等試劑均為分析純；水為超純水。

流動注射化學發光分析儀(IFFM-E，西安瑞邁分析儀器有限公司)，多功能化學發光檢測器(IFFM-A，西安瑞邁分析儀器有限公司)；高效液相色譜儀(E2695，美國Waters公司)，電子天平(MS105DU，d=0.01 mg，梅特勒-托利多)；優普超純水機(UPH-Ⅱ-40，成都超純科技有限公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(RV10，德國IKA公司)；索氏提取儀等。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 延胡索乙素對照品溶液制備 精確稱取1.78 mg延胡索乙素對照品，甲醇溶解并用純水定容到50 mL容量瓶中，得質量濃度為0.035 6 mg·mL-1的對照品溶液。精確稱取5.40 mg延胡索乙素對照品，甲醇溶解并于50 mL容量瓶中定容，得質量濃度為0.108 0 mg·mL-1的對照品溶液，分別置4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 Ce4+儲備液(1.0×10-2mol·L-1)制備 精確稱取1.671 6 g(NH4)4Ce(SO4)4，用0.1 mol·L-1H2SO4溶解并定容于250 mL容量瓶，用時逐級稀釋。

2.1.3 羅丹明B儲備液(0.3 mg·mL-1)制備 準確稱取75.0 g羅丹明 B，少量無水乙醇溶解，再用純水定容于250 mL容量瓶中，用時逐級稀釋。

2.1.4 供試樣品制備 準確稱取用乙醚脫脂的延胡索粉末2.0 g，置具塞三角瓶中，加入氨水-甲醇(1∶20)100 mL，稱重；10 ℃水中冷浸30 min，超聲提取(功率120 W，頻率40 kHz，時間1 h)，冷卻，稱重，用上述混合液補足減失的量，搖勻，濾過，蒸干；用甲醇溶解并于25 mL容量瓶中定容，備用。

2.2 分析檢測方法設計

2.2.1 CL-FIA分析檢測設計 準確移取質量濃度為0.035 6 mg·mL-1延胡索乙素對照品溶液13.0 mL，純水定容于50 mL容量瓶中，然后分別取0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于50 mL容量瓶中配成梯度溶液。開啟蠕動泵，預熱流動注射化學發光分析儀30 min，將相對應溶液由八通閥泵入流通池里，待基線穩定后進標樣，產生的化學發光信號由IFFM-E型流動注射化學發光分析儀檢測，Remex軟件記錄實驗數據。以加入延胡索乙素對照品溶液質量濃度為橫坐標，空白體系的發光強度和加入延胡索乙素對照品溶液后發光強度的差值為縱坐標，繪制標準曲線。

取供試樣品溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中純水定容，搖勻；再取稀釋液1.0 mL純水定容于100 mL容量瓶中。取最終稀釋后的供試樣品溶液按上述條件進行檢測，計算樣品溶液中總生物堿得率。

2.2.2 HPLC分析檢測設計 采用ODS-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%三乙胺(50∶50)；檢測波長：284 nm，流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10.0 μL；柱溫：30 ℃。

分別移取質量濃度為0.108 0 mg·mL-1的延胡索乙素對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中甲醇定容，高效液相色譜儀測定峰面積。以延胡索乙素對照品質量濃度為橫坐標，延胡索乙素積分峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

取1.0 mL總生物堿樣品溶液，于25 mL容量瓶中甲醇定容，按上述色譜條件進行檢測，記錄峰面積。根據標準曲線方程得樣品溶液中總生物堿濃度，計算總生物堿得率。

3 結果與分析

3.1 CL-FIA結果與分析

3.1.1 化學發光動力學性質 實驗所建立的Ce4+-羅丹明B體系中，化學發光動力學曲線表明，在羅丹明B存在的情況下，Ce4+-H+體系快速氧化延胡索乙素而產生強烈化學發光，約1.8 s后達到最大值，又經過5.4 s衰減到極限，見圖1。

注：a.延胡索；b.空白對照。圖1 化學發光動力學曲線

3.1.2 流路及參數選擇 參照方肇倫[17]FIA流程圖，比較不同流路對化學發光強度的影響。經多次測試，選擇主副泵的4根輸液管分別插入HNO3溶液、Ce4+溶液、羅丹明B溶液、對照品溶液(或供試樣品溶液)，主泵流速為4.02 mL·min-1，副泵流速為5.36 mL·min-1，負高壓為800 V，增益為1，信噪比最佳。

3.1.3 反應介質選擇 分別以相同濃度的H2SO4、HCl、H3PO4、HNO3為反應介質，考察各介質對化學發光強度的影響。結果表明，在HNO3介質中化學發光強度最大，故選HNO3為反應介質。進而考察HNO3質量濃度在0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 mol·L-1對化學發光的影響。結果顯示，化學發光強度開始隨酸濃度的增大而增大，后又逐漸變小，故選擇1.0 mol·L-1的HNO3為最優反應介質，見圖2。

圖2 HNO3質量濃度對體系發光強度的影響

3.1.4 Ce4+溶液濃度的選擇 固定其他條件不變，考察質量濃度為2.0×10-4、4.0×10-4、8.0×10-4、1.2×10-3、1.6×10-3、2.0×10-3mol·L-1的Ce4+溶液對發光強度的影響。結果表明，發光強度隨Ce4+溶液濃度增加而增強，當Ce4+溶液質量濃度為1.2×10-3mol·L-1時發光強度達到最大，繼續增加其濃度發光強度反而減弱，因此選該濃度為最佳濃度，見圖3。

圖3 Ce4+質量濃度對體系發光強度的影響

3.1.5 羅丹明B濃度的選擇 固定其他條件不變，考察濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg·mL-1的羅丹明B對發光強度的影響。結果顯示，發光強度隨羅丹明B質量濃度增加而增強，當其質量濃度為0.3 mg·mL-1時發光強度不再增強，且開始減弱，故選此濃度為最佳濃度，見圖4。

圖4 羅丹明B質量濃度對體系發光強度的影響

3.1.6 標準曲線、精密度和檢出限 以延胡索乙素對照品溶液的質量濃度(C)為橫坐標，空白體系的發光強度和加入延胡索乙素對照品溶液后的發光強度的差值(ΔI)為縱坐標，繪制標準曲線。延胡索乙素質量濃度在0.014 24～0.227 84 μg·mL-1與發光強度呈線性關系，線性方程為Y=187 48X+449.23，r=0.996 4。

對0.227 84 μg·mL-1的延胡索乙素對照品溶液平行測定11次，RSD=1.39%，表明儀器的精密度良好。根據IUPAC建議，以3倍空白標準偏差計算該方法的檢出限為0.009 06 μg·mL-1。

3.1.7 干擾試驗結果 在優化的條件下，考察延胡索總生物堿中的可能組分對延胡索總生物堿測定的干擾(以對發光強度的影響不超過±5%計)。對0.056 96 μg·mL-1的延胡索乙素對照品溶液進行干擾性考察試驗表明，1000倍的Ca2+、K+、Al3+、NH4+、SO42-和Cl-，500倍的淀粉，100倍的葡萄糖、蔗糖、糊精，10倍的維生素C均未超出允許量，表明本實驗建立的化學發光體系有抗干擾性。

3.1.8樣品的CL-FIA分析結果及回收率 按照制作標準曲線的方法檢測樣品，計算樣品中總生物堿得率。由表1可看出，延胡索總生物堿平均得率為0.597%，RSD=2.32%。

加樣回收率試驗表明，延胡索總生物堿的平均回收率為98.85%，RSD=1.50%，表明該檢測方法準確度高，見表2。

表2 CL-FIA檢測延胡索總生物堿加樣回收率試驗結果

3.2 HPLC檢測結果與分析

3.2.1 標準曲線建立 試驗結果表明，延胡索總生物堿在10.8～54.0 μg·mL-1與峰面積線性關系良好，回歸方程為Y=167 34X-102 43(r=0.999 5，n=5)。

3.2.2 精密度試驗 精確吸取21.6 μg·mL-1的延胡索乙素對照品溶液10.0 μL，按照標準曲線的建立方法測定峰面積，平行測定11次，計算得RSD=1.67%，表明儀器的精密度良好。

3.2.3 穩定性試驗 精確吸取供試品溶液10.0 μL，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣，測得峰面積值，計算得RSD=2.13%，表明供試品溶液中延胡索生物堿在24 h內穩定。

3.2.4 樣品的分析結果及回收率 相同條件下測定樣品中總生物堿峰面積，計算樣品中總生物堿的含量。由表3可知，延胡索總生物堿平均得率為0.606%，RSD=1.41%，見圖5、6和表3。

圖5 延胡索乙素對照品色譜圖

圖6 延胡索樣品色譜圖

表3 延胡索總生物堿的HPLC分析結果(n=3)

加樣回收率試驗表明，平均回收率為97.56%，RSD=1.63%，表明該檢測方法的準確度高，見表4。

表4 HPLC檢測延胡索總生物堿加樣回收率試驗結果

4 討論

研究結果表明，在優化的條件下，Ce4+-羅丹明B化學發光體系相對發光強度與延胡索總生物堿在0.014 24～0.227 84 μg·mL-1呈良好的線性關系，該方法的檢出限為0.009 06 μg·mL-1。延胡索乙素的制劑化學發光檢測有報道，李麗清等[12]研究了延胡索乙素-高錳酸鉀-連二亞硫酸鈉體系，建立了化學發光法測定羅通定片劑中延胡索乙素含量的新方法，方法的檢出限為 3.2×10-9g·mL-1。

Ce(Ⅳ)與某些還原性藥物反應時，能產生弱的化學發光，加入羅丹明6G、羅丹明B、奎寧等熒光物質時，利用熒光的化學激發，能大大增強體系的發光強度[13]。Abdulrahman A Al-W[18]研究報道，在酸性條件Ce(IV)可直接氧化葉酸，羅丹明B對其發光具有增強作用，據此建立測定的葉酸化學發光體系。Ju Peng Wang等[19]研究發現，在酸性介質中，阿魏酸對Ce4+-羅丹明6G體系發光具有增強作用，建立了測定阿魏酸的化學發光分析方法，檢出限為8.7×10-9mol·L-1。范順利等[20]利用頭孢拉定的降解產物在羅丹明6G作為增敏劑的條件下與Ce(Ⅳ)反應產生化學發光，建立了測定頭孢拉定的方法，檢出限為0.05 μg·L-1。何樹華[21]發現，在硝酸介質中，Ce(IV)氧化連二亞硫酸鈉產生較弱的化學發光，左炔諾孕酮可以顯著增強此發光，且其檢出限為4.6 μg·L-1。文獻分析表明，化學發光法檢測不同的藥品或植物活性組分，篩選相應的化學發光體系是關鍵，而不同的化學發光體系最適合的氧化劑也不同，影響因素較多。本實驗研究所建立的分析檢測延胡索總生物堿的CL-FIA法其檢出限較低，靈敏度較高。

CL-FIA與HPLC檢測結果比較發現，前者分析的延胡索總生物堿含量略低于HPLC檢測的結果。CL-FIA法具有儀器簡單、分析速度快、節省試劑、成本低等特點。該方法為延胡索總生物堿的分析檢測提供了另一新途徑，在其藥材品質分析及制劑的質量控制方面具有實際的應用價值。

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DeterminationofAlkaloidsinCorydalisyanhusuobyChemiluminescence-FlowInjectionAnalysis

ZHU Haiping，SHIHongyan，WANGShibao，YANGPeijun*

(SchoolofBiologicalScienceandEngineering，ShaanxiUniversityofTechnology，ShaanxiProvinceKeyLaboratoryofBio-resources，Hanzhong723001，China)

Objective：To determine the content of alkaloids inCorydalisyanhusuoby Chemiluminescence-Flow Injection Analysis(CL-FIA).Methods：Total alkaloids in the tubers ofC.yanhusuowere found to strongly enhance the Chemiluminescence signal of Ce4+-Rhodamine B system in nitric acid medium.Therefore，a new method was developed for the determination of the alkaloids by CL-FIA，based on the interference test and compared the data of CL-FIA with that of HPLC.Results：Under the optimum conditions，the linear range for the alkaloids was 0.014 24-0.227 84 μg·mL-1(r=0.996 4)and the detection limit was 0.009 06 μg·mL-1.The average yield was 0.597%(RSD=1.39%).Conclusion：The established method is more simple，rapid and more sensitive.It is a practical method for detecting total alkaloid inC.yanhusuo.

Corydalisyanhusuo；Chemiluminescence；Flow-injection；alkaloids；determination

2015-04-06)

陜西省教育廳基金項目(12JS026，13JS020)

*

楊培君，教授，研究方向：資源植物；E-mail：yang@snut.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.003