紫草素抑制STAT3信號通路對人絨毛膜癌JEG-3細胞遷移和侵襲能力的影響

王慧智，李會影，徐清雨，馬志*

(1.牡丹江醫學院 紅旗醫院 婦產科，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院 紅旗醫院 兒外科，黑龍江 牡丹江 157011)

·基礎研究·

紫草素抑制STAT3信號通路對人絨毛膜癌JEG-3細胞遷移和侵襲能力的影響

王慧智1，李會影1，徐清雨2，馬志2*

(1.牡丹江醫學院 紅旗醫院 婦產科，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院 紅旗醫院 兒外科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的：觀察紫草素抑制信號傳導和轉錄激活因子-3(STAT3)信號通路對人絨毛膜癌JEG-3細胞遷移和侵襲能力的影響，探討其抗絨毛膜癌的可能機制。方法：體外培養JEG-3細胞，加入0.2、0.4 μg·mL-1紫草素作為實驗組，陰性對照組加入等體積0.1%二甲基亞砜，甲氨蝶呤組(MTX組)作為陽性對照組加入2 μg·mL-1MTX。采用劃痕修復實驗、Transwell小室體外侵襲實驗，觀察紫草素對JEG-3細胞遷移和侵襲能力的影響。采用免疫組織化學分析STAT3和酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)陽性細胞的表達。進一步采用Real-Time PCR分析STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達。結果：紫草素可顯著抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力(P<0.05或P<0.01)，降低STAT3和p-STAT3陽性細胞的表達以及STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)。結論：紫草素能明顯抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力，其機制可能與抑制STAT3信號通路有關。

紫草素；遷移；侵襲；信號傳導和轉錄激活因子-3信號通路

絨毛膜癌(choriocarcinoma)也稱絨毛膜上皮癌，簡稱絨癌，是一種來源于滋養細胞的高度惡性腫瘤，其特點是滋養細胞失去了原來的絨毛或葡萄胎的結構，而散在地侵入子宮肌層，早期即可發生血道和淋巴系統轉移，導致患者迅速死亡[1]。遷移和侵襲是絨毛膜癌的重要特征，是滋養細胞腫瘤發生發展過程中的早期事件[2]。所以，研究絨毛膜癌細胞的遷移和侵襲機制必將為其治療指明新的方向。某些轉錄因子調節滋養細胞的遷移和侵襲過程，可能參與了絨毛膜癌的發生和發展。信號傳導和轉錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)是 JAK-STAT信號通路中一種非常關鍵性的轉錄因子，是多種致癌信號通路的匯聚點。STAT3是公認的癌基因，如乳腺癌、大腸癌等可表現為高表達[3-4]。有研究表明，紫草素可誘導人絨毛膜癌JEG-3細胞凋亡[5]，但是其是否抑制JEG-3細胞的遷移和侵襲尚未見報道。本研究旨在探討紫草素對JEG-3細胞遷移、侵襲能力以及STAT3信號通路的影響，為明確紫草素抑制JEG-3細胞的遷移和侵襲提供實驗依據，探討其可能的作用機制，為其開發應用奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 細胞株與試藥

人絨毛膜癌細胞JEG-3(中國科學院動物研究所計劃生育生殖生物學國家重點實驗室)；DMEM培養液(美國HyClone公司)；甲氨蝶呤(MTX，美國輝瑞制藥有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、Hoechst33342(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；基質膠Matrigel(美國BD公司)；STAT3鼠單克隆抗體和酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)鼠單克隆抗體(美國ProMab公司)；HRP標記抗鼠IgG二抗(上海碧云天公司)；M-MLV逆轉錄試劑盒(Reverse Transcriptase kit promega，Japan)；其他試劑均為分析純。紫草素(北京市藥品檢驗所，溶解于0.1%二甲基亞砜，配成0.4 μg·mL-1溶液，-20 ℃保存，臨用時，以DMEM培養液稀釋到所需濃度)。

1.2 細胞培養

JEG-3細胞保存在含有10%BSA的DMEM培養液(含2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，1 mmol·L-1丙酮酸鈉和100 U·mL-1青霉素)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養。當JEG-3細胞達80%匯合度時，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養48 h。收集懸浮的細胞經EDTA處理制備成單細胞懸液，然后用DMEM培養液洗滌細胞。收集對數生長期細胞，用于后續實驗。

2 方法

2.1 劃痕修復實驗

JEG-3細胞按照細胞密度5×104個細胞/孔接種于6孔板中，待細胞單層生長鋪滿板底時，用移液槍頭沿培養板底部劃“一”字型劃痕，加入終濃度為0.2 μg·mL-1紫草素(低劑量組)，0.4 μg·mL-1紫草素(高劑量組)[6]，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養24 h。陰性對照組加入等體積0.1%DMSO，陽性對照組(MTX組)加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實驗組完全一致。倒置顯微鏡下檢測細胞向致傷區遷移的相對距離并拍照，計算細胞遷移率。細胞遷移率(%)=(1-藥物組細胞遷移面積/對照組細胞遷移面積)×100%。每組實驗重復3次，取其平均值。

2.2 Transwell小室體外侵襲實驗

Transwell小室用前鋪上50 μL 0.5% Matrigel膜基質37 ℃孵育過夜。JEG-3細胞加入終濃度為0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養24 h。陰性對照組加入等體積0.1%DMSO，MTX組加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實驗組完全一致。調整細胞密度5×104個細胞·mL-1，分別取200 μL接種于Transwell小室內室，并在Transwell小室下室加入含有10% BSA的DMEM培養液。孵育24 h后，取出Transwell小室去除未穿膜細胞。甲醇固定15 min后，再以10 mg·mL-1Hoechst33342染色30 min[7]。OlympusIX51熒光顯微鏡計數穿過微孔膜的細胞數。每組細胞隨機計數10個視野，取其平均值，實驗重復3次。

2.3 免疫組織化學分析

JEG-3細胞胰蛋白酶消化、離心、500 μL DMEM培養液重懸。無菌乙醇洗滌，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下過夜培養。當細胞貼在蓋玻片上后更換新鮮培養液，加入終濃度為0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養2 h。陰性對照組加入等體積0.1%DMSO，MTX組加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實驗組完全一致。95%乙醇固定，中性樹膠粘到載玻片上，PBS洗滌3次，滴加一抗(陰性對照組以PBS代替一抗)，室溫培養3 h，PBS洗滌3次。滴加HRP標記的二抗，室溫培養15 min，PBS洗滌3次。滴加DAB顯色劑初染，蘇木素復染，中性樹膠蓋玻片封片，倒置顯微鏡鏡檢。結果判斷標準：STAT3和p-STAT3蛋白陽性細胞均呈棕褐色陽性顆粒樣物質，主要位于細胞質，胞核內可有輕度黃染。每張圖片隨機選取10個高倍視野，Smart scape圖像分析系統對陽性染色細胞區域進行分析。

2.4 Real-Time PCR分析

JEG-3細胞加入終濃度為0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養24 h。陰性對照組加入等體積0.1% DMSO，MTX組加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實驗組完全一致。按照TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA。Nanodrop2000檢測RNA純度。使用M-MLV逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說明書進行。利用Pubmed查找相關基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物。STAT3正向引物：5′-CAGACGGGCATTGTGGAT-3′，反向引物：5′-AGTCTTGGGCATGTCAGTGTG-3′，共224bp；p-STAT3正向引物：5′-TTGCCAGCACAAAGACACTCC-3′，反向引物：5′-CTCCAAAGCAAACCGAATACAG-3′，共135 bp；β-actin正向引物：5′-CCAGTATGATTCTA-CCCACGGC-3′，反向引物：5′-CGGAGATGATGACC-CTTTTGGC-3′，共227 bp。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物進行擴增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀測出ΔC值及熔解曲線，計算出相對基因表達量。每份樣品檢測3次。

2.5 數據統計分析

3 結果

3.1 劃痕修復實驗結果

陰性對照組可見JEG-3細胞遷移率明顯增高，而紫草素對JEG-3細胞遷移具有明顯抑制作用，并呈濃度依賴性，與陰性對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與MTX組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。以上結果提示紫草素可以抑制JEG-3細胞遷移能力。結果見圖1和圖2。

注：A.陰性對照組；B.低劑量組；C.高劑量組；D.MTX組。圖1 紫草素對JEG-3細胞劃痕修復實驗結果(×100)

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，下同。圖2 紫草素對JEG-3細胞細胞遷移率結果

3.2 Transwell小室體外侵襲實驗結果

陰性對照組可見JEG-3細胞侵襲穿膜細胞數明顯增多，而紫草素對JEG-3細胞侵襲穿膜細胞數具有明顯抑制作用，并呈濃度依賴性，與陰性對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與MTX組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。以上結果提示紫草素可以抑制JEG-3細胞侵襲能力。結果見圖3和圖4。

注：A.陰性對照組；B.低劑量組；C.高劑量組；D.MTX組。圖3 紫草素對JEG-3細胞Transwell小室體外侵襲實驗結果(×200)

圖4 紫草素對JEG-3細胞穿膜細胞個數結果

3.3免疫組織化學分析結果

陰性對照組表現STAT3和p-STAT3陽性細胞高表達，可見胞質內分布大量的濃密的棕褐色陽性顆粒，而紫草素可使STAT3和p-STAT3陽性細胞顯著減少，可見內皮細胞胞質內棕褐色陽性顆粒減少，并且呈劑量依賴性。提示紫草素顯著減少STAT3和p-STAT3陽性細胞的高表達。結果見圖5。

注：A～D.STAT3免疫組織化學分析結果；E～F.p-STAT3免疫組織化學分析結果；A、E為陰性對照組；B、F為低劑量組；C、G為高劑量組；D、H為MTX組。圖5 STAT3和p-STAT3免疫組織化學分析結果(×400)

3.4 Real-Time PCR分析結果

陰性對照組可見STAT3mRNA和p-STAT3mRNA呈高表達，而紫草素可使STAT3mRNA和p-STAT3mRNA顯著降低，并且呈劑量依賴性，提示紫草素顯著減少STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達。結果見圖6。

圖6 STAT3 mRNA和p-STAT3 mRNA Real-Time PCR分析結果

4 討論

紫草素是從我國傳統中藥天山紫草根部提取出來的萘醌色素，具有抗炎、抑制脂肪形成、抗腫瘤、調節免疫等廣泛的藥理作用及生物學效應[8]，其中抗腫瘤作用是目前研究的熱點和重點。研究表明，紫草素對多種抗腫瘤增殖具有明顯的抑制作用，如對肝癌、結腸癌、卵巢癌及絨毛膜癌等[9-12]。另有研究表明，紫草素還能夠抑制非小細胞肺癌A549 細胞和人胃癌細胞SGC-7901的遷移和侵襲能力[13-14]。然而紫草素對JEG-3細胞是否具有抑制遷移和侵襲作用，目前尚不明確。本研究以不同終濃度紫草素作用于JEG-3細胞，結果發現紫草素顯著抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力。此結果提示紫草素可作為抗絨毛膜癌的潛在性選擇藥物。

為了闡明紫草素抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力的機制，本研究對STAT3信號轉導通路進行了分析?，F階段，STAT3信號轉導通路在腫瘤發生和發展過程中的重要作用受到學者的高度重視。STAT3是人類惡性腫瘤中最常見且易被激活的STAT家族成員，主要介導細胞間或者細胞外信號向細胞內的轉導，是一個十分重要的信號轉導因子，其在腫瘤發生和惡性轉變中有重要的作用，在多種實體瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌和卵巢癌等中均有異常表達和活性增強，已經成為潛在的腫瘤治療靶點[15-16]。當STAT3被上游的JAK激活后，活化形成p-STAT3，隨后p-STAT3形成二聚體，進而進入細胞核，調節與癌細胞增殖、分化、遷移和侵襲等相關的靶基因轉錄活性[17]。Segatto等[18]報道，STAT3及其活化形式p-STAT3都會促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。本研究免疫組織化學分析結果發現，紫草素明顯減少STAT3和p-STAT3陽性細胞的表達，提示其可能是抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力的機制。進一步采用Real-Time PCR分析STAT3mRNA和p-STAT3mRNA。結果發現，紫草素可抑制STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達，結果與免疫組織化學分析相一致，進一步證實紫草素抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力的機制可能與抑制STAT3信號轉導通路有關。

綜上所述，紫草素抑制JEG-3細胞遷移和侵襲能力，抑制STAT3信號轉導通路可能是其機制之一。

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EffectofShikoninonSuppressingMigrationgandInvationgofJEG-3CellsthroughInhibitingSTAT3SignalPathway

WANGHuizhi1，LIHuiying1，XUQingyu2，MAZhi2*

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology，HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China；2.DepartmentofPediatricsurgery，HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China)

Objective：To investigate the effect of shikonin on suppressing migration and invation of JEG-3 cells through inhibiting signal transducer and activator of transcription-3(STAT3)signal pathway and discuss the possible mechanisms of anti-choriocarcinoma.Methods：JEG-3 cells were culturedinvitroand treated with shikonin at 0.2 μg·mL-1and 0.4 μg·mL-1concentrations as experimental group，the negative control group was treated with equal volume of 0.1% DMSO，MTX group(methotrexate group)was treated with 2 μg·mL-1MTX as positive control group.Wound healing assay and transwell chamber invasion assay were used to detect the effect of shikonin on migration and invasion of JEG-3 cells.Immunohistochemistry was used to detect the expression of STAT3and tyrosine phosphorylation STAT3(p-STAT3)positive cells.Real-Time PCR analysis was used to detect the expression of STAT3mRNA and p-STAT3mRNA.Results：Shikonin could inhibit migration and invasion of JEG-3 cells(P<0.05 orP<0.01)，the expression of STAT3and p-STAT3positive cells and the expression of STAT3mRNA and p-STAT3mRNA were inhibited significantly(P<0.05 orP<0.01).Conclusion：Shikonin could inhibit migration and invasion of JEG-3 cells，the mechanism may be inhibition of STAT3signal pathway.

Shikonin；migration；invasion；Signal transducer and activator of transcription-3 signal pathway

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.006

2015-07-08)

*

馬志，碩士，主治醫師，研究方向：兒科常見腫瘤的臨床治療；E-mail：mz13945307895@163.com