微波輔助提取款冬花多糖的工藝及抗氧化活性研究*

宋逍段璽唐志書王昌利趙鵬

微波輔助提取款冬花多糖的工藝及抗氧化活性研究*

宋逍①段璽②唐志書①王昌利①趙鵬①

目的：研究款冬花多糖微波輔助提取工藝及其抗氧化活性。方法：通過單因素實驗，對影響款冬花多糖提取率的料液比、微波功率、微波時間進行考察，最后，選用正交實驗對提取工藝參數進行優化，并研究款冬花多糖對羥基自由基、超氧陰離子的清除作用。結果：實驗結果表明，款冬花多糖微波輔助提取最佳實驗條件為料液比為1∶30（g/mL），微波功率為600 W，微波時間為7 min，在此條件下，多糖得率為14.806%。隨著款冬花多糖濃度的增大，其清除羥基自由基、超氧陰離子的能力也隨之增加。結論：款冬花多糖具有一定的抗氧化性，并對羥自由基、超氧自由基有較強的清除能力。

款冬花； 多糖； 微波提取； 抗氧化活性

First-author’s address：Pharmacy College of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Xianyang 712046，China

款冬花為菊科植物款冬（Tussilagofar-fara）的干燥花蕾，為常用中藥材之一，具有潤肺止咳、化痰平喘之功效[1]，其主要有效成分為萜類、黃酮、生物堿、有機酸和精油等[2-5]。近年來研究發現款冬花中有效成分多糖具有一定的抗腫瘤作用[6-7]，因而對其進一步開發研究，具有廣闊的應用前景。

目前，關于款冬花多糖的提取研究，主要采用傳統水提、超聲提取的研究方法，而關于款冬花多糖微波提取的方法鮮有報道[8-12]。基于此，本研究利用微波提取技術[13-17]，對款冬花多糖提取工藝運用正交實驗優化篩選，并以抗氧化性實驗對提取的款冬花多糖進行活性研究，為款冬花的實際應用開發研究提供一定的科研基礎和思路。

1　材料與方法

1.1材料 于西安萬壽路中藥材批發市場自購款冬花實驗藥材，經陜西中醫藥大學生藥教研室王繼濤教授鑒定為菊科植物款冬（Tussilago farfara L.）的干燥花蕾。

1.2儀器及試劑 UV-265型紫外分光光度計（日本島津公司），AL204型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），中科中佳HC-3618R冷凍離心機DZF-602真空干燥箱（上海申賢恒溫設備廠），微波爐美的EG823MF4-NA；旋轉蒸發儀RE-52AA（上海嘉鵬科技有限公司）。乙醇、乙醚、丙酮、葡萄糖、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

1.3實驗方法

1.3.1原料的提取 取款冬花花蕾，于80 ℃烘箱中烘干，粗粉碎，過篩。按照1∶3（g/mL）條件用無水乙醚回流提取2 h，脫脂，在70 ℃烘箱中干燥后再按前面1∶3（g/mL）條件用85%乙醇回流提取2 h，以除去單糖等雜質，再在70 ℃烘箱中干燥備用。

1.3.2單因素實驗 取款冬花粉末，按照相關實驗條件進行：以料液比1∶30（g/mL），設定微波功率為400 W，時間為5 min，并在不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60），不同微波功率（200、300、400、500、600、700 W），不同微波時間（3、4、5、6、7、8 min）下考察上述條件對款冬花多糖得率的影響。

1.3.3正交實驗 在上述實驗的基礎上，以料液比、微波功率、微波時間3個因素，按照L934設計三因素三水平實驗，見表1。

表1　正交實驗因素水平表

1.3.4款冬花多糖提取方法 取80 ℃下烘干的款冬花→粉碎后，過70目篩→脫脂及除去單糖等雜質→微波提取→抽濾，濾液測定多糖含量→Sevage法去蛋白→水相加入乙醇，4 ℃沉淀過夜→4 ℃冷凍離心，沉淀，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌3次→80 ℃真空干燥至恒重→款冬花多糖。

1.3.5標準曲線的繪制及多糖提取率計算 精密稱取葡萄糖標準品100 mg，至100 mL容量瓶中用蒸餾水溶解定容，搖勻，配成1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別吸取2、4、6、8、10 mL葡萄糖標準溶液定容到50 mL，而后各吸取上述標準溶液1.0 mL 置25 mL具塞比色瓶中，分別加新鮮配制的5%苯酚1 mL，98%濃硫酸5 mL，各自震蕩搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，冷至室溫，以蒸餾水為空白對照，490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程y=12.9083x+0.0077（r=0.9998）。精密吸取前述定容的款冬花多糖溶液1.0 mL，按照前法測定吸光度值，代入標準曲線計算多糖含量，按照下式計算多糖得率：款冬花多糖得率（%）=（提取液中多糖質量/原料質量）×100%

1.3.6抗氧化性實驗 分別配制50、100、200、400、800、960、1200 μg/mL不同濃度的款冬花多糖溶液各進行羥基自由基清除能力、超氧陰離子的清除作用的抗氧化活性實驗，其中采用Fenton反應-分光光度法測定羥基自由基清除能力[18]。采用鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子的清除作用[19-20]。

2　結果

2.1單因素考察結果

2.1.1料液比對多糖得率的影響 由圖1可知，隨著料液比的增加，款冬花多糖得率逐步增加，當料液比達到1∶30（g/mL）后，款冬花多糖提取得率達最大值，后續隨著料液比再增加，得率不增且有降低的趨勢，分析原因可能是因為溶劑量的增加，導致其他成分的溶出從而影響到多糖的溶出，因而同等提取時間下得率下降。故本研究確定最佳料液比為1∶30（g/mL）。

圖1　料液比對多糖得率的影響

2.1.2微波功率對多糖得率的影響 設置微波功率在200～500 W范圍內，隨著其功率不斷的增加，由圖2可知，款冬花多糖的的得率逐漸升高，而當微波功率超過500 W后，多糖得率逐步下降，分析原因可能是因微波功率過高，產生的熱量增加，破壞了款冬花多糖結構，從而引起多糖降解，致使多糖得率下降，故款冬花多糖微波最佳的提取功率為500 W。

2.1.3微波時間對多糖得率的影響 設定微波提取時間在3～6 min范圍內，由圖3結果可知，隨著提取時間的延長多糖得率隨之增加，當微波提取時間到6 min時達到最大值，而后隨著時間的增加，款冬花多糖得率降低，分析原因可能是微波長時間作用，使多糖分子結構發生變化，促使多糖降解，從而導致多糖得率下降，故設定6 min為微波最佳提取時間。

圖2　微波功率對多糖得率的影響

圖3　微波時間對多糖得率的影響

2.2款冬花多糖微波提取工藝的正交實驗結果 依據前面單因素的實驗基礎，以料液比、微波提取時間、微波功率3個顯著影響款冬花多糖得率的因素為對象結合款冬花多糖得率為評價指標，設計正交實驗，以篩選微波提取款冬花多糖的最佳工藝，見表2。

表2　微波提取正交實驗結果

通過極差R值的比較可以看出，影響款冬花多糖得率因素的主要因素為料液比>微波時間>微波功率，款冬花多糖微波提取的最佳條件為A2B2C3，即料液比為1∶30（g/mL），微波提取功率為600 W，微波提取時間為7 min。以此條件，進行款冬花多糖3次平行提取實驗，款冬花多糖得率分別為14.856%、14.753%、14.811%平均值為14.806%，表明該條件穩定可行。

2.3款冬花多糖抗氧化實驗結果

2.3.1羥基自由基清除能力測定 由圖4可知，隨著款冬花多糖濃度的增加其對羥基自由基的清除能力隨之升高，且當多糖濃度為1200 μg/mL時，其清除率達57.89%，而羥基自由基是人體內最主要的自由基，其消除率是反映藥物抗氧作用的重要指標。此實驗表明款冬花多糖具有較強的羥自由基清除能力。

圖4　多糖對羥基自由基的清除作用

2.3.2超氧陰離子清除能力測定 由圖5可知，隨著款冬花多糖濃度的增大其清除超氧陰離子的能力也隨之增加，當款冬花多糖濃度為時1200 μg/mL，清除率達47.85%，表明款冬花多糖具有較好的抗氧化活性。

圖5　多糖對超氧陰離子的清除作用

3　討論

本論文在單因素實驗的基礎上結合正交實驗，以提取的料液比、微波功率和微波時間為影響因素結合款冬花多糖得率為評價指標，考察多糖得率影響的主要因素次序為：料液比>微波時間>微波功率，篩選出款冬花多糖微波提取的最佳條件為：料液比為1∶30（g/mL），微波功率為600 W，微波時間為7 min，多糖得率為14.806%，與傳統水提及超聲提取比較，不但節約了時間，而且提高了多糖得率。另外，抗氧化實驗結果表明，隨著款冬花多糖濃度的增加其分別對羥基自由基和超氧陰離子的清除能力也隨之增加，具有一定的量效關系，說明款冬花多糖具有一定的抗氧化活性。

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Study on Microwave-assisted Extraction and the Antioxidant Activeties of Polysaccharide from Tussilagofar-fara

SONG Xiao，DUAN Xi，TANG Zhi-shu，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：027-030

Objective：The microwave extraction process of polysaccharide from Tussilagofar-fara and its antioxidant activity were investigated.Method：Orthogonal test was carried out on the basis of single-factorexperiments to determine the optimum process parameters.Additional，the reducing power of Tussilagofar-fara polysaccharide and the clearance effect of hydroxyl radicals，superoxide anion were investigated.Result：The experimental results showed that the Tussilagofar-fara polysaccharide microwave assisted extraction optimum experiment conditions for the material liquid ratio was 1∶30 （g/mL），microwave power 600 W，extracting time was 7 min，and the crude polysaccharide yield was up 14.806%.With the increased of Tussilagofarfara polysaccharide concentration，its ability to scavenge hydroxyl radicals，superoxide anion also increased. Conclusion：Furthermore，the Tussilagofar-fara polysaccharide had better reducing power to scavenge hydroxyl radicals，superoxide anion and natural antioxidant.

Tussilagofar-fara； Polysaccharide； Microwave extraction； Antioxidant activity

陜西省自然科學基礎研究計劃項目（2014JQ4146）；陜西省中藥制藥重點學科專項基金資助（1008）；陜西省大學生創新創業訓練計劃項目（1580）

①陜西中醫藥大學藥學院 陜西 咸陽 712046

②陜西中醫藥大學附屬醫院

宋逍

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.008

2016-03-03） （本文編輯：蔡元元）