酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用對小鼠創口愈合的影響

李鑫焱程橋凡浙錄張恒海張倩

酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用對小鼠創口愈合的影響

李鑫焱①程橋②凡浙錄②張恒海②張倩②

目的：研究酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因對創面粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的表達和傷口愈合的影響。方法：選取清潔級雄性成年昆明小鼠128只，隨機分為四組，D組小鼠腹腔注射等劑量的氯化鈉溶液0.1 mL/（kg·12 h）；L組于傷口周圍浸潤注射0.5%的羅哌卡因1 mL/（kg·12 h）；N組腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射液5 mg/（kg·12 h）；H組腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射5 mg/（kg·12 h）復合創口周圍浸潤注射0.5%的羅哌卡因1 mL/（kg·12 h）。在小鼠手術切口模型完成后的第3、7、10天，每次不放回地從每組中隨機抽取8只小鼠隨后用Elisa法測定剪取組織中的GM-CSF濃度，并觀測每組剩余8只小鼠的切口愈合時間和情況。結果：H組小鼠在第7、10天時傷口GM-CSF 表達較D組高（P<0.05）；在愈合時間上，H組較D組的愈合時間短（P<0.05）；在愈合后瘢痕面積來看，H組的瘢痕面積較L組小（P<0.05），與D組比較差異也有統計學意義（P<0.05）。結論：酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用可促進小鼠創面粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達，加快傷口的愈合，且不會引起瘢痕的過度增生。

酮咯酸氨丁三醇； 羅哌卡因； 傷口愈合

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

隨著外科發展以及各種鎮痛藥物的發展更新，術后鎮痛已經成為了臨床麻醉鎮痛的一個受到廣泛關注的問題。隨著現代疼痛學的發展和各種鎮痛藥物的不斷更新換代，術后鎮痛也由單模式單種藥物鎮痛逐漸發展為多模式、多種藥物復合應用鎮痛。藥物復合應用可以減小單個藥物的用量，同時可以達到良好的鎮痛效果。其中，傷口周圍浸潤局麻藥作為一種操作簡便、價格低廉且不良反應少的術后鎮痛方式，在臨床上有著廣泛的應用。羅哌卡因是一種長效的酰胺類局麻藥物，曾有學者在氣管插管全麻開顱手術聯合應用羅哌卡因阻滯頭皮神經，結果顯示聯合應用羅哌卡因組血流動力學較單純全麻組穩定，鎮痛效果良好[1]。非甾體類抗炎藥通過抑制環氧合酶（COX）的活性抑制前列腺素的生成，在術后鎮痛中發揮著重要的作用。有劉付麗[2]的研究顯示，在腹腔鏡膽囊切除術后腹腔內注射羅哌卡因并靜脈注射帕瑞昔布鈉具有良好的鎮痛效果，減少術后嗎啡用量。第一代非甾體類抗炎藥物——酮咯酸氨丁三醇，是第一個可供注射的非甾體類鎮痛藥物。有實驗支持酮咯酸氨丁三醇用于燒傷患者的術后鎮痛效果較好，不良反應少這一結論[3]。而這些藥物在臨床上應用于術后鎮痛時雖然可以達到鎮痛的效果，但其對手術切口的愈合是否有影響還尚待研究。GM-CSF即粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，多位學者研究發現其有促進創面愈合的作用，有臨床觀察研究顯示，應用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子可以促進深Ⅱ度燒傷創面的愈合，并防止感染[4]。目前有研究發現，0.5%羅哌卡因用于傷口局部浸潤可以促進GM-CSF的表達，有促進傷口愈合的作用[5]。本課題主要研究的是羅哌卡因和酮咯酸氨丁三醇合用對創口周圍的GM-CSF的表達及創面的愈合是否有影響。

1　材料與方法

1.1材料 取8周齡清潔的雄性昆明小鼠128只，體重30～40 g（山西省腫瘤醫院動物實驗中心）。小鼠GM-CSF ELISA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）、酮咯酸氨丁三醇注射液、鹽酸羅哌卡因注射液。

1.2分組 128只小鼠隨機分為四組，每組32只，分別為對照組（D組）、羅哌卡因組（L組）、酮咯酸氨丁三醇組（N組）、酮咯酸氨丁三醇聯合羅哌卡因組（H組）。

1.3模型制備 清潔級雄性昆明小鼠128只，0.6%戊巴比妥鈉以0.1 mL/10 g行腹腔麻醉，麻妥后固定背部皮膚，用電動剃毛器剃去小鼠頸部以下約3 cm×3 cm大小面積的體毛，以脊柱正中，頸部以下約1 cm處標記約1 cm×1 cm的方形標記。常規消毒，沿標記做全層皮膚缺損。D組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.1 mL/（kg·12 h），L組于創口周圍浸潤注射0.5%羅哌卡因0.1 mL/（kg·12 h），N組小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射液5 mg/（kg·12 h），H組小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射5 mg/（kg·12 h）并且創口周圍浸潤注射0.5%羅哌卡因1 mL/（kg·12 h），并將各只小鼠單籠飼養。

1.4標本處理 于術后第3、7、10天從各組中隨機取8只小鼠處死，后剪取距創口4 mm的包括創面的皮膚組織，所取標本清理后置于-80 ℃冰箱中保存。將所取標本制成勻漿后離心，留取上層清液，用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附法（Elisa法）測定剪取的皮膚組織中GM-CSF的濃度，為了減少剪取組織的誤差，筆者同時選用BCA測定蛋白法測定組織中的總蛋白濃度，計算兩者的比值以比較各組標本中GM-CSF的含量。其余小鼠繼續飼養至其創面完全愈合，并記錄其完全愈合所需要的天數和愈合后的瘢痕面積。

1.5觀察指標

1.5.1GM-CSF的表達 小鼠造模成功后第3、7、10天從各組中隨機取8只小鼠處死后所取的創面皮膚組織，用Elisa法測定組織中GM-CSF的濃度，并用BCA蛋白法測定組織中總的蛋白濃度，計算出每只小鼠的GM-CSF的濃度/總蛋白濃度的比值，并通過統計學方法進行分析[5]。

1.5.2創面完全愈合所需時間和愈合后瘢痕的面積 將四組剩余的小鼠繼續給藥直至創面完全愈合并記錄創面完全愈合所需要的天數。后將這些小鼠處死，剪取距瘢痕周圍1 cm左右的皮膚，在手術顯微鏡下觀察瘢痕的寬度和長度并測量記錄[6]。

1.6統計學處理 應用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析法（ANOVA），組間相互比較采用LSD-t檢驗的方法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1創面GM-CSF含量 在創面形成后的第3、7、10天，各組創面的GM-CSF占總蛋白的比值逐漸降低，各組之間第3天GM-CSF占總蛋白的百分比比較差異均無統計學意義（P>0.05），第7、10天，各組之間GM-CSF占總蛋白的百分比比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1　小鼠創面GM-CSF/BCA比值（±s） %

表1　小鼠創面GM-CSF/BCA比值（±s） %

組別　第3天　第7天　第10天D組（n=8）　28.013±6.219　20.862±4.885　12.938±7.504※▲N組（n=8）　30.088±8.349　20.900±5.124　11.950±5.039 L組（n=8）　32.925±5.454　31.063±6.688*△　23.938±4.178 H組（n=8）　33.000±7.640　27.575±5.499#　20.213±8.417 F值　0.948　6.590　6.286 P值　0.431　0.002　0.002

2.2創面愈合時間和愈合后瘢痕面積 各組愈合時間、瘢痕面積比較差異均有統計學意義（P<0.001），見表2。

表2　各組小鼠創面愈合時間和愈合后瘢痕面積（±s）

表2　各組小鼠創面愈合時間和愈合后瘢痕面積（±s）

*與L組比較，P<0.001；△與H組比較，P=0.002；#與H組比較，P=0.008；※與D組比較，P=0.014；▲與L組比較，P=0.019

組別　愈合時間（d）　瘢痕面積（mm2）D組（n=8）　18.875±2.167*△　11.526±2.876 N組（n=8）　20.125±2.475　10.149±2.615 L組（n=8）　12.000±2.000#　18.649±2.437 H組（n=8）　15.125±2.100　15.187±3.154※▲F值　22.694　15.111 P值　<0.001　<0.001

3　討論

創口愈合的過程是機體對外來損傷所做出修復的過程。一般包括以下4個階段：止血、炎癥、增殖與重新塑形階段。其中，創傷后所引起機體的炎癥反應在傷口的愈合中有非常重要的作用。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）是一種多功能造血生長因子，可刺激造血前體細胞增殖、分化、向外周轉移，又可誘導多種細胞如巨噬細胞、角質細胞等的分化、增殖、活化，而且對其他細胞如成纖維細胞、膠質細胞及皮膚黏膜細胞等具有刺激生長作用[7]，曾被Kaplan等最早在1992年首次把GM-CSF引入急性皮膚創面治療，證實創周注射rhGM-CSF證實可促進急性皮膚缺損創面愈合[8]。在體外，他們發現GM-CSF 可刺激角質細胞生長，是誘導朗罕細胞分裂增殖的主要因子。本實驗組前期研究證明，于小鼠傷口周圍局部浸潤0.5%的羅哌卡因，傷口周圍組織的GM-CSF的濃度升高，且創面愈合時間縮短，證明創周浸潤羅哌卡因可以促進創口的愈合[5]。

酮咯酸氨丁三醇是一種非選擇性的環氧合酶（COX）抑制劑，它主要是通過抑制COX的活性發揮止痛的作用。Cepeda等[9]的研究發現術后應用酮咯酸可以明顯減少術后嗎啡的用量，證明其有強大的鎮痛作用。COX包括三種：COX-1、COX-2、COX-3，其中COX-2是前列腺素生物合成的關鍵酶。譚趙云[10]等有研究表明，COX-2和VEGF的表達存在一定的正相關性，并且在增生性瘢痕中存在高表達的現象。

由本實驗中可以看出，在造模后第7、10天，與對照組比較，羅哌卡因組的創口GM-CSF的表達明顯升高（P<0.05），證明創面周圍浸潤羅哌卡因可促進切口周圍GM-CSF分泌，與本實驗組前期得出羅哌卡因用于傷口局部浸潤可以促進GM-CSF的表達這一結果吻合[5]。在造模后的第10天，酮咯酸氨丁三醇組GM-CSF分泌較對照組低（P<0.05），推測可能是酮咯酸氨丁三醇抑制了GM-CSF的表達，但尚未有文獻報道。第7、10天，酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用組與對照組比較，小鼠切口周圍GM-CSF的表達上升（P<0.05），但合用組GM-CSF的表達低于羅哌卡因組（P<0.05），推測可能是羅哌卡因促進了創面周圍的GM-CSF的分泌。有實驗研究顯示，COX-2在抑制樹突狀細胞的分化成熟方面有重要作用，并且GM-CSF可刺激樹突狀細胞的分化[11]，但并未有證據顯示COX-2與GM-CSF之間存在關聯性。說明兩種藥物合用可以促進創口周圍GM-CSF分泌，但促進作用不如單純局部浸潤羅哌卡因明顯。

在愈合時間方面看，羅哌卡因組愈合所用時間較對照組短（P<0.05），也證實了羅哌卡因促進傷口愈合這一結論[5]。而與對照組比較，兩種藥物合用創口愈合所用時間縮短（P<0.05），說明兩種藥物合用可以加速創面的愈合，縮短愈合時間。從瘢痕的面積比較來看，羅哌卡因組的瘢痕面積大于對照組（P<0.05），可能與GM-CSF可以直接和間接促進成纖維細胞增殖和分泌膠原，且促進巨噬細胞分泌血管內皮細胞生長因子（VEGF-6）、轉化生長因子-β （TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子有關[12]，其中VEGF可以直接促進血管新生，可促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性[13]。而這些細胞因子被證明與病理性瘢痕的形成、增生有關，但具體機制尚不清楚[14]。其中，而酮咯酸氨丁三醇組的瘢痕面積較對照組?。≒<0.05），推測可能是酮咯酸氨丁三醇抑制了瘢痕增生。羅嘉倫等[15]采用小鼠體內實驗研究表明，在50 μmol/L的尼美舒利的作用下，小鼠創口愈合時間與對照組相比無明顯差異，而創面則可以達到最佳修復效果，證明COX-2在病理性瘢痕的發生、發展過程中起到了重要的調控作用。而本實驗中酮咯酸氨丁三醇為非選擇性的COX抑制劑，也與其研究結果較為吻合。而兩種藥物合用時瘢痕的面積要小于羅哌卡因組（P<0.05），且瘢痕較為光滑平整，可能和酮咯酸氨丁三醇抑制病理性瘢痕的作用有關。實驗結果顯示兩種藥物合用時可促進創面GM-CSF的分泌，縮短小鼠創口愈合時間，而酮咯酸氨丁三醇又可通過抑制COX-2的活性來抑制瘢痕過度增生，促進創面的修復，但兩種藥物合用促進傷口愈合的機制、是否有藥物相互的作用尚不十分清楚。另外，兩種藥物合用時各種藥物的最適濃度、合用的時機、同時又能達到良好的鎮痛效果等等問題仍是以后的實驗中需要研究的方向。

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Effects of Ketorolac Tromethamine Combine with Ropivacaine on Wound Healing in Mice

LI Xinyan，CHENG Qiao，FAN Zhe-lu，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：024-027

Objective：To study the effect of ketorolac tromethamine and ropivacaine on the expression of GM-CSF involved in wound healing.Method：The 128 healthy adult male Kunming mice，cleaning grade，were randomly divided into four groups and group D assigned to be injected intraperitoneally Saline with a equal dose 0.1 mL/（kg·12 h）.Group L injected 0.5% Ropivacaine 1 mL/（kg·12 h） around the cut.N group intraperitoneally Ketorolac Tromethamine 5 mg/（kg·12 h）.Group H injected Ropivacaine 1 mL/（kg·12 h）around the cut combineing with intraperitoneally Ketorolac Tromethamine 5 mg/（kg·12 h），respectively，in 12 hours.After the completion of the incision in mice models，we randomly selected eight mice without being putted back from every group at the 3rd，the 7thand the 10thday，then measured the expression of GM-CSF by Elisa. The rest 8 mice in the every group would be continued to feed to heal completely in order to record the time that the wound healing takes and observe the intertion status.Result：The expression of GM-CSF between group H and D were compared，group H was higher at 7th，10thday（P<0.05）.The healing time of group H was shorter than that of group D（P<0.05）.The area of scar in the group H was smaller than group L（P<0.05），compared with group D，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Ropivacaine combining with Ketorolac Tromethamine can increase the expression of GM-CSF and promote the healing of wound without causing the excessive scar hyperplasia.

Ketorolac Tromethamine； Ropivacaine； Wound healing

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.007

①山西醫科大學 山西 太原 030001

②山西醫科大學第一臨床醫學院

程橋

2015-12-10） （本文編輯：蔡元元）