常規(guī)精液檢查及優(yōu)化處理后的精液參數(shù)對常規(guī)IVF受精結(jié)局的預(yù)測價(jià)值

孫青，李觀貴，熊風(fēng)，成金泉，萬才云，彭月婷，黃菊，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳　518045；2.深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳　518045)

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常規(guī)精液檢查及優(yōu)化處理后的精液參數(shù)對常規(guī)IVF受精結(jié)局的預(yù)測價(jià)值

孫青1，2，李觀貴1，2，熊風(fēng)1，2，成金泉1，2，萬才云1，2，彭月婷1，2，黃菊1，2，曾勇1，2*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518045；2.深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳518045)

目的分析促排卵前常規(guī)精液檢查及取卵當(dāng)日處理后的精液參數(shù)對常規(guī)體外受精(IVF)結(jié)局的預(yù)測作用和影響。方法回顧性分析2011年1月至2014年12月期間2 647個(gè)常規(guī)IVF治療周期。根據(jù)受精率是否低于50%，將患者分為低受精率組(受精率<50%，n=157)和正常受精率組(受精率≥50%，n=2 490)。比較兩組患者間的基礎(chǔ)資料、精液參數(shù)、胚胎發(fā)育、胚胎種植率以及臨床妊娠情況。采用多因素logistic回歸和受試者工作特征曲線(ROC)分析促排卵前常規(guī)精液檢查及取卵當(dāng)日的各種單一或綜合精液參數(shù)指標(biāo)對IVF低受精率的預(yù)測能力。結(jié)果除不育年限(P<0.05)外，兩組間的基礎(chǔ)資料包括女方年齡、男方年齡、女方BMI、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)和男性不育原因構(gòu)成比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相比于正常受精率組，低受精率組的卵裂率(90.69%vs. 95.98%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(40.54%vs. 50.89%)、胚胎種植率(18.91%vs. 31.86%)以及臨床妊娠率(35.67%vs. 57.15%)均顯著降低(P<0.05)。兩組間各項(xiàng)精液參數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多因素logistic回歸分析顯示促排卵前常規(guī)精液檢查指標(biāo)中正常形態(tài)精子百分率(aOR0.935；95%CI:0.898-0.974)和正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)(aOR0.299；95%CI:0.143-0.623)，以及取卵日優(yōu)化處理后的活動精子百分率(aOR0.972；95%CI:0.957-0.988)對預(yù)測低受精率的發(fā)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC分析結(jié)果顯示常規(guī)精液檢查中的正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)和優(yōu)化處理后的活動精子百分率的曲線下面積均為0.636，大于正常形態(tài)精子百分率的曲線下面積0.604。結(jié)論精液常規(guī)檢查中的正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)和優(yōu)化處理后的活動精子百分率可作為預(yù)測常規(guī)IVF低受精率的指標(biāo)。

常規(guī)IVF；活動精子百分率；活動精子總數(shù)；受精率

【Abstract】

Objective：To investigate the predictive value of semen parameters in routine semen analysis and after optimal selection on the day of ovum pickup (OPU) in fertilization outcome in patients undergone conventional IVF (cIVF).

Methods：The data of 2 647 cIVF cycles from January 2011 to December 2014 were retrospectively analyzed. The cycles were divided into two groups：low fertilization rate (FR) group (<50%，n=157) and normal FR group (≥50%，n=2 490). Baseline characteristics，semen parameters in routine semen analysis and after optimal selection on the OPU day，embryo development，implantation rate and clinical pregnancy outcome were compared between the two groups. Logistic regression and receiver operating characteristic curve (ROC) were used to determine which semen parameters could be used to predict the occurrence of low FR.

Results：No significant differences were found in female age，male age，female BMI，number of oocytes retrieved，number of embryos transferred，and constituent ratio of male infertile factors (P>0.05)，except infertility years (P<0.05) between the two groups. However，the cleavage rate (90.69% vs. 95.98%)，good quality embryo rate (40.54% vs. 50.89%)，implantation rat (18.91% vs. 31.86%) and clinical pregnancy rate (35.67% vs 57.15%) in low FR group were significantly lower than those in normal FR group (P<0.05). Moreover，all the semen parameters showed significant differences between the two groups. Analysis of logistic regression demonstrated that normal morphology sperm rate (NMSR) (aOR0.935；95%CI:0.898-0.974) and total normal progressive sperm count (TNPS) (aOR0.299；95%CI:0.143-0.623) in routine semen analysis and the motile sperm rate (MSR) (aOR0.972；95%CI:0.957-0.988) after optimal selection on the OPU day had significance for predicting the occurrence of low FR. Furthermore，ROC results showed that the area under the curve (AUC) of TNPS in routine semen analysis and MSR after optimal selection were all 0.636，which is larger than that of NMSR in routine semen analysis (AUC=0.604).

Conclusions：TNPS in routine semen analysis and MSR after optimal selection may be as index for predicting the occurrence of low fertilization in cIVF.

(JReprodMed2016，25(9)：787-793)

大約50%的不孕不育癥是由男方因素引起的[1]。不良生活習(xí)慣和某些特殊職業(yè)及泌尿生殖系統(tǒng)炎癥感染等因素是男性精液質(zhì)量下降的重要原因[2]。精液常規(guī)檢查是臨床上輔助生殖技術(shù)(ART)治療前評估男性生殖功能的一個(gè)基本的、重要的項(xiàng)目[3]，同時(shí)也對預(yù)測ART結(jié)局及ART技術(shù)方式選擇有一定的參考價(jià)值[4-5]。然而，單一精液參數(shù)的某個(gè)特定值不能準(zhǔn)確預(yù)測行ART夫婦的受孕潛能[3]。例如，有研究表明根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版(以下簡稱第5版手冊)精子形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測IVF結(jié)局有一定的局限性[6]。近幾年，有研究報(bào)道綜合精液參數(shù)——促排卵前常規(guī)精液檢測中正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)對IVF受精率有重要的影響，可作為一個(gè)獨(dú)立的精液質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)指導(dǎo)ART治療[7]。但也有研究認(rèn)為取卵日優(yōu)化處理后的各項(xiàng)精液參數(shù)在預(yù)測精子的IVF能力方面有重要意義，尤其是優(yōu)化處理后的精液活力[8]或前向運(yùn)動精子總數(shù)[9]與IVF受精率密切相關(guān)。然而，到目前為止還沒有研究對促排卵前常規(guī)精液檢測以及取卵日優(yōu)化處理后的單一或綜合精液參數(shù)對IVF受精結(jié)局的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行評估。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2011年1月至2014年12月期間在本中心接受常規(guī)IVF治療的2 647個(gè)取卵周期。

入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)第一周期；(2)女方采用標(biāo)準(zhǔn)方案(1 969例)、常規(guī)長方案(660例)、短方案(17例)、超超長方案(1例)進(jìn)行控制性超排卵；(3)女方排除輸卵管積水、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等因素；(4)新鮮手淫取精標(biāo)本；(5)新鮮周期移植胚胎。

我們中心在D1(取卵日定為D0)觀察常規(guī)IVF的受精情況，若受精率低于50%，則進(jìn)行晚期補(bǔ)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)(簡稱“晚補(bǔ)ICSI”)，因此將受精率為50%作為切割點(diǎn)，將患者分為兩組：低受精率組(受精率<50%，157例)，正常受精組(受精率≥50%，2 490例)

二、診療回顧

1.促排卵前常規(guī)精液檢測與處理：取卵日前最近3個(gè)月內(nèi)，參照WHO第5版手冊的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行精液的采集及處理。采用Makler計(jì)數(shù)池(Sefi-Makler，以色列)載樣于SCA計(jì)算機(jī)輔助精液分析操作系統(tǒng)(Microptic，西班牙)，進(jìn)行精子濃度及活力分析；精子形態(tài)學(xué)分析采用Diff-Quik快速染色液(Medion Diagnostics，瑞士)進(jìn)行染色，并且根據(jù)第5版手冊的精子形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行人工分析。

2.IVF術(shù)前精液處理：男方禁欲3～7 d，于取卵日以手淫法取精，室溫液化后，記錄精液量、液化時(shí)間。密度梯度離心法處理精子，并采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析操作系統(tǒng)檢測精子密度、活動率、a+b級精子比例，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至授精。

3.控制性超排卵和卵母細(xì)胞收集：超排卵采用本中心標(biāo)準(zhǔn)方案、常規(guī)長方案、短方案以及超超長方案，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時(shí)，肌注HCG(麗珠制藥)，注射后34～36 h左右行陰道B超穿刺取卵，卵母細(xì)胞放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)直至授精。

4.體外受精和胚胎培養(yǎng)：卵母細(xì)胞培養(yǎng)3～5 h后授精，加入精子量為每個(gè)卵母細(xì)胞5～10萬個(gè)精子。受精后16～18 h去除卵丘細(xì)胞，觀察受精情況，出現(xiàn)2個(gè)原核為正常受精。觀察受精后胚胎的卵裂及發(fā)育情況。受精后72 h根據(jù)本中心實(shí)際情況制定的胚胎評分系統(tǒng)評判胚胎分級，然后選擇2～3個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植。

5.妊娠結(jié)局判斷：胚胎移植后14 d后驗(yàn)?zāi)騂CG，呈陽性為生化妊娠。移植后5周超聲檢查見子宮腔內(nèi)妊娠囊及原始搏動即確定為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若樣本呈正態(tài)分布，兩組組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若為非正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

用多因素logistic回歸分析不同精液參數(shù)對低受精率的影響，獲得比值比(OR)和95%的置信區(qū)間(CI)。多因素分析采用進(jìn)入方法進(jìn)行回歸分析。參數(shù)中以總數(shù)表示的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為log以10為底的對數(shù)，進(jìn)行多因素分析。將女方年齡、男方年齡、不孕年限、女方BMI、獲卵數(shù)等因素納入logistic回歸模型進(jìn)行校準(zhǔn)。利用受試者工作特征曲線(ROC)分析不同精液參數(shù)對低受精率的預(yù)測能力。

結(jié)　　果

一、不同受精率組患者的基本情況

本研究共納入2 647個(gè)常規(guī)IVF-ET周期，低受精率組和正常受精率組在女方年齡、男方年齡、女方BMI以及男性因素不育構(gòu)成比率上的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，低受精率組的不育年限顯著長于正常受精率組(P<0.05)(表1)。

二、不同受精率組患者的胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局情況

低受精率組和正常受精率組在獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)上的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組的平均受精率分別為28.53%和83.98%。另外，低受精率組的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率以及臨床妊娠率都顯著低于正常受精率組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

三、不同受精率組患者的各項(xiàng)精液參數(shù)情況

如表3所示，通過t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示低受精率組患者的精液參數(shù)平均值都顯著低于正常受精率組(P<0.05)。

四、多因素logistic回歸分析

常規(guī)精液檢查及優(yōu)化處理后精液參數(shù)與常規(guī)IVF低受精率的關(guān)系：以受精率是否低于50%為因變量，以常規(guī)精液檢查的單一精液參數(shù)(包括精子濃度、前向運(yùn)動精子百分率、活動精子百分率、正常形態(tài)精子百分率)，綜合精液參數(shù)(包括精子總數(shù)、前向運(yùn)動精子總數(shù)、活動精子總數(shù)、正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù))以及優(yōu)化處理后的單一精液參數(shù)(精子濃度、

表1　各組患者的基本情況[(x-±s)，n(%)]

注：與正常受精率組比較，*P<0.05

表2　各組患者胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局情況[(x-±s)，n(%)]

注：與正常受精率組比較，#P<0.01

表3　各組患者促排卵前精液檢查及取卵日優(yōu)化處理后精液參數(shù)情況[(x-±s)]

注：與正常受精率組比較，*P<0.05，#P<0.01

前向運(yùn)動精子百分率、活動精子百分率)，綜合精液參數(shù)(包括精子總數(shù)、前向運(yùn)動精子總數(shù)、活動精子總數(shù))進(jìn)行多因素logistic回歸分析(表4)。用女方年齡、男方年齡、不育年限、女方BMI、獲卵數(shù)校準(zhǔn)后，結(jié)果顯示常規(guī)精液檢查中的正常形態(tài)精子百分率(aOR0.935；95%CI:0.898-0.974)和正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)(aOR0.299；95%CI:0.143-0.623)，以及優(yōu)化處理后的活動精子百分率(aOR0.972；95%CI:0.957-0.988)對低受精率的發(fā)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即這些精液參數(shù)的數(shù)值越小，IVF低受精率的發(fā)生概率越高(表4)。

五、ROC曲線分析精液參數(shù)對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測能力

如表5所示，ROC曲線分析常規(guī)精液檢查中的正常形態(tài)精子百分率及正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)，以及優(yōu)化處理后的活動精子百分率對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測能力。結(jié)果顯示，正常形態(tài)精子百分率、正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)以及活動精子百分率的曲線下面積分別為0.604、0.636和0.636，截點(diǎn)值分別為7.915%、11.05×106和73.650%。相比而言，正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)和活動精子百分率兩者對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測價(jià)值較高。

表4　多因素logistic回歸分析各項(xiàng)精液參數(shù)對常規(guī)IVF低受精率的影響

注：※將女方年齡、男方年齡、不育年限、女方BMI、獲卵數(shù)納入回歸模型中進(jìn)行校準(zhǔn)

表5　ROC曲線分析精液參數(shù)對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測能力

討　　論

精液常規(guī)分析是臨床最常用的評估男性生育功能的主要檢查項(xiàng)目，同時(shí)也是ART治療前評估精液水平，選擇ART治療方式的依據(jù)之一。在可育人群研究中，Slama等[10]指出精液參數(shù)與成功受孕所需要的時(shí)間(簡稱“受孕時(shí)間”)具有一定的相關(guān)性，當(dāng)精子濃度小于20×106/ml，受孕幾率降低；精子濃度或正常精子形態(tài)分別在55×106/ml或39%的范圍內(nèi)能夠影響受孕時(shí)間，但超過該值并不縮短受孕時(shí)間。然而，有研究報(bào)道獲得自然妊娠的不育夫婦的男方精液參數(shù)包括精子形態(tài)和精子活力之間具有較大的差異性，并且ROC曲線分析結(jié)果指出精子形態(tài)和精子活力這些精液參數(shù)對不育夫婦自然懷孕的預(yù)測價(jià)值是有限的[11]。

ART，包括IVF和ICSI，是治療男性因素引起不育癥的主要技術(shù)。在不育夫婦行ART治療過程中，有研究認(rèn)為精液各項(xiàng)參數(shù)如精子形態(tài)[4，6]、精子濃度[12]以及精子活力[12-13]對IVF受精率都有影響，并對IVF結(jié)局有一定的預(yù)測作用。此外，解凍后精子活力可作為供精常規(guī)IVF臨床結(jié)果的預(yù)測指標(biāo)[14]。精子形態(tài)和精子活動總數(shù)對人工授精的妊娠結(jié)局也具有一定的預(yù)測價(jià)值[5，15]。但是，近幾年來有研究指出單一的精液參數(shù)對IVF結(jié)局的預(yù)測具有局限性[3，16]。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道精液中有效活動精子總數(shù)比單一的精子濃度、精子活力和精子形態(tài)更能反映精子質(zhì)量和男性生育能力[7，17-18]。這與WHO第5版手冊中多次提出的總數(shù)優(yōu)先觀點(diǎn)是一致的[19]。只是這些研究大多是通過將精液參數(shù)進(jìn)行主觀分組后比較其對IVF胚胎受精、發(fā)育以及臨床妊娠情況，例如顧斌等[17]以及陳志恒等[9]發(fā)現(xiàn)優(yōu)化處理后前向運(yùn)動精子總數(shù)<5×106對IVF受精結(jié)局有影響。然而，我們的回顧性研究是基于以觀察D1受精率低于50%則作為常規(guī)IVF患者部分卵母細(xì)胞行晚補(bǔ)ICSI的背景下，因此將患者分為低受精率組和正常受精率組，比較兩組間各項(xiàng)精液參數(shù)、胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的差異。結(jié)果顯示低受精率組的各項(xiàng)精液參數(shù)、卵裂率、優(yōu)胚率、胚胎種植率以及臨床妊娠率都顯著低于正常受精率組(表2，表3)。但是，需要指出的是，低受精率組和正常受精率組之間的例數(shù)相差較大，這也與低受精率組中患者數(shù)量不多有直接關(guān)系，今后的研究需要大樣本的數(shù)據(jù)來支持我們的結(jié)論。后續(xù)則進(jìn)行多因素logistic回歸和ROC曲線分析各項(xiàng)精液參數(shù)與常規(guī)IVF低受精率的關(guān)系。這與Repping等[20]通過多因素logistic回歸分析和ROC曲線共同分析活動精子總數(shù)對完全受精失敗的預(yù)測價(jià)值的研究方法類似，但是我們沒有建立不同的模型來預(yù)測低受精率的發(fā)生，這是本文的不足之處之一。從多因素logistic回歸分析結(jié)果中可以看到，促排卵前常規(guī)精液檢查中的正常形態(tài)精子百分率和正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)以及取卵日優(yōu)化處理后的活動精子百分率是影響常規(guī)IVF低受精率(受精率低于50%)的重要因素，表明這些精液參數(shù)對預(yù)測常規(guī)IVF低受精發(fā)生有重要意義。已有研究利用多因素logistic回歸分析顯示取卵日精子前向運(yùn)動百分率與受精成敗相關(guān)[21]，這與我們得出的結(jié)論存在不一致，但主要原因在于該研究是利用常規(guī)IVF受精率小于25%定義為受精失敗來觀察精液參數(shù)與受精失敗的相關(guān)性。另外，該研究的樣本量相對較少也可能是造成差異的原因之一。

通過多因素logistic回歸分析找出影響低受精率的重要因素后，再利用ROC曲線分析這3個(gè)精液參數(shù)對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)和活動精子百分率的曲線下面積大于正常形態(tài)精子百分率的曲線下面積(表5)，前兩者的截點(diǎn)值分別為11.05×106和73.65%。但是，我們沒有采用截點(diǎn)值將患者進(jìn)行前瞻性分組試驗(yàn)以考察截點(diǎn)值對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測效果，這也是本研究的不足之處。王鳳英等[8]通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)處理后的精子活力與受精率明顯相關(guān)。蔡靖等[7]認(rèn)為隨著正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)增加，IVF受精率明顯增加。由此看來，我們的結(jié)果與上述研究具有一致性。值得一提的是，我們首次采用多因素logistic回歸同時(shí)分析促排卵前常規(guī)精液檢查以及取卵日優(yōu)化處理后所有單一和綜合精液參數(shù)對IVF受精率的評估能力，并且表明常規(guī)精液檢查中的正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)和優(yōu)化處理后的活動精子百分率對常規(guī)IVF低受精率具有預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，男方精液參數(shù)對常規(guī)IVF受精結(jié)局具有一定的預(yù)測價(jià)值，尤其是促排卵前常規(guī)精液檢查中的正常形態(tài)前向運(yùn)動精子總數(shù)和優(yōu)化處理后的活動精子百分率。需要指出的是本研究僅為回顧性研究，初步探討了常規(guī)精液檢查及優(yōu)化處理后的精液參數(shù)對常規(guī)IVF低受精率的預(yù)測價(jià)值，但仍存在許多不足的地方，需采用前瞻性的對照實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步研究，以防止常規(guī)IVF中出現(xiàn)低受精率的情況。

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[編輯：王慧萍]

Predictive value of semen parameters in routine semen analysis and after optimal selection in fertilization outcome of conventional IVF

SUN Qing1，2，LI Guan-gui1，2，XIONG Feng1，2，CHENG Jin-quan1，2，WAN Cai-yun1，2，PENG Yue-ting1，2，HUANG Ju1，2，ZENG Yong1，2*

1.ShenzhenKeyLaboratoryofReproductiveImmunologyforPeri-implantation，F(xiàn)ertilityCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，Shenzhen518045 2.ShenzhenZhongshanInstituteforReproductionandGenetics，Shenzhen518045

Conventional IVF；Motile sperm；Total motile sperm count；Fertilization

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.005

2016-01-06；

2016-02-16

深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20150402165325174)；深圳市衛(wèi)計(jì)委科技計(jì)劃項(xiàng)目(201402156)

孫青，女，浙江杭州人，博士，助理研究員，生理學(xué)專業(yè).(*

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