一株煙草根際溶磷細(xì)菌的篩選鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化

劉虎，侯貞，易建華，周東波，周曙光，劉凱，汪城墻，丁延芹，杜秉海*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安2710182.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，湖南長(zhǎng)沙410007

一株煙草根際溶磷細(xì)菌的篩選鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化

劉虎1，侯貞1，易建華2*，周東波2，周曙光2，劉凱1，汪城墻1，丁延芹1，杜秉海1*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018
2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，湖南長(zhǎng)沙410007

溶磷微生物可以加速土壤磷素循環(huán)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有較好的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)以無(wú)機(jī)磷為唯一磷源的選擇性培養(yǎng)基從煙田土壤中篩選具有溶磷功能的細(xì)菌，同時(shí)分別運(yùn)用鉬銻抗顯色法、Salkowski顯色法對(duì)其溶磷能力、產(chǎn)IAA能力進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)生理生化特征和16S rRNA測(cè)序?qū)θ芰仔Ч^好的菌株JP6進(jìn)行鑒定。通過(guò)模擬試驗(yàn)驗(yàn)證JP6對(duì)土壤中有效磷釋放的影響；運(yùn)用單因子試驗(yàn)確定最佳碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源和無(wú)機(jī)鹽，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基配比優(yōu)化。結(jié)果顯示：菌株JP6具有較好的溶磷能力，發(fā)酵液中有效磷含量為50.1mg/L，同時(shí)該菌株具有產(chǎn)IAA能力，在R2A培養(yǎng)基中分泌IAA含量為128.9μg/m L，通過(guò)生理生化和16S rRNA序列比對(duì)將JP6鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），在土壤中具有較好的溶磷作用，最佳培養(yǎng)基配比為在10%黃豆芽基礎(chǔ)上1.5%葡萄糖，2%豆粕，0.5%NH4Cl，0.5%CaCO3。

溶磷細(xì)菌；陰溝腸桿菌；篩選；鑒定；培養(yǎng)基優(yōu)化

磷素是植物生長(zhǎng)所需的重要元素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，提高植物的抗旱能力，同時(shí)影響植物的光合作用［1，2］以及呼吸作用。磷素在土壤中廣泛存在，施用磷肥的70%～90%被固定在土壤中變成無(wú)效磷，無(wú)法被植物利用［3，4］。大量使用磷肥會(huì)增加生產(chǎn)成本，引起環(huán)境污染，同時(shí)會(huì)降低農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，土壤板結(jié)［5］。具有溶磷能力的植物根際促生細(xì)菌（PGPR）能夠?qū)⑼寥乐须y溶性磷轉(zhuǎn)化為有效磷，為植物提供養(yǎng)分［6］；產(chǎn)生長(zhǎng)素也是PGPR直接促生機(jī)制之一［7］。細(xì)菌分泌的3-吲哚乙酸（IAA）可以增強(qiáng)細(xì)胞的滲透吸水能力［8］，也會(huì)激發(fā)植物自身激素的分泌，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，但是也有報(bào)道單純具有產(chǎn)IAA功能的菌株對(duì)作物的促生效果不明顯［9］。因此利用土壤微生物的生命活動(dòng)加速土壤中的磷素循環(huán)、提高植物磷素利用率，同時(shí)利用細(xì)菌產(chǎn)生長(zhǎng)素共同促進(jìn)植物生長(zhǎng)具有良好的應(yīng)用前景。

文獻(xiàn)報(bào)道的溶磷細(xì)菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、固氮菌屬（Azotobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）、沙雷氏菌（Serratia）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細(xì)菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Micrococcus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Chromabacterium）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、布克氏菌屬（Burkholderia）、勞爾氏菌屬（Ralastonia）、泛菌屬（Pantoea）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）［10-15］。陸瑞霞［16］，李曉舉［17］和李明新［18］已報(bào)道陰溝腸桿菌具有溶磷功能，但是同時(shí)具有溶磷和產(chǎn)生長(zhǎng)素功能的陰溝腸桿菌少有報(bào)道。

本研究利用無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基在湖南瀏陽(yáng)煙科所煙田土壤中篩選出一株同時(shí)具有溶磷和產(chǎn)生長(zhǎng)素功能的陰溝腸桿菌，同時(shí)對(duì)JP6進(jìn)行土壤溶磷模擬試驗(yàn)和培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)和田間應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣土樣取自湖南省瀏陽(yáng)煙科所煙田煙草根際，存于密封袋中，4℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g；CaCO35.0 g，KCl0.3 g，Ca3（PO4）210 g，蒸餾水定容至1000m L，pH值7.2～7.4。其中Ca3（PO4）2單獨(dú)稱量，每100m L分裝1 g。121℃滅菌20min。

無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基：同上添加瓊脂18～20 g。

R2A培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酪蛋白氨基酸0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，丙酮酸鈉0.3 g溶于1 L水中，用K2HPO4和KH2PO4將pH調(diào)至7.2，121℃滅菌20min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆芽100 g，蔗糖50 g，pH自然。新鮮黃豆芽100 g，加水100m L，煮沸30min，用紗布過(guò)濾。用水補(bǔ)足原量，再加入蔗糖50 g，煮沸溶化。121℃滅菌20m in。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1000m L pH 7.0，121℃滅菌20min。

Salkowski顯色液：500m L 35%HClO4，10m L 0.5mol/L FeCl3。

1.2方法

1.2.1溶磷菌的分離純化稱新鮮土壤10 g，置于內(nèi)含玻璃珠和90m L無(wú)菌水的250m L三角瓶中，170 r/min振蕩30min，然后系列梯度稀釋，將10-5、10-6、10-7梯度取0.1m L涂布于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度重復(fù)3次，置于28℃培養(yǎng)24～48 h。采用溶磷圈方法［19］篩選，挑取產(chǎn)生透明圈的分離物進(jìn)行純化。將純化的細(xì)菌分離物點(diǎn)接到無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)4 d，測(cè)定溶磷圈直徑D，菌落直徑d，并測(cè)量溶磷比（溶磷圈直徑/菌落直徑），篩選出效果較好的菌株。

1.2.2溶磷菌發(fā)酵液有效磷含量測(cè)定采用鉬銻抗顯色方法［20］對(duì)初篩效果較好的菌株進(jìn)行溶磷能力測(cè)定。具體操作如下：（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在6個(gè)50m L容量瓶中分別加入0m L、0.1m L、0.2m L、0.3 m L、0.4m L、0.5m L的100mg/m L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，加2滴2，6-二硝基苯酚作為指示劑，加鉬銻抗顯色劑5m L，定容至刻度，使標(biāo)準(zhǔn)磷濃度分別為0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L，搖勻。在室溫下反應(yīng)30m in后，用紫外分光光度計(jì)在720 nm處比色，根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）發(fā)酵液制備：將活化好的菌株接種到LB斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2 d。將生長(zhǎng)好的菌苔用無(wú)菌水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，制成108cfu/m L菌懸液。按1%接種量接至50m L液體溶磷培養(yǎng)基中，對(duì)照以無(wú)菌水代替，每處理5個(gè)平行，180 r/m in，30℃，搖床中培養(yǎng)4 d。（3）測(cè)定方法：將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管，超聲波細(xì)胞粉碎處理20m in；4000 rpm/m in，離心20min后吸取上清液待測(cè)；吸取適量上清液于50m L容量瓶中，用水稀釋至總體積約3/5處，加入2～3滴2，4-二硝基酚，并調(diào)pH至溶液剛呈微黃色，加入5m L鉬銻抗試劑，搖勻，加水定容，室溫放置30m in，720 nm處比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出磷濃度，并計(jì)算發(fā)酵液中有效磷含量。

1.2.3產(chǎn)IAA能力測(cè)定采用Salkowski顯色方法［21］，計(jì)算菌濃度OD600值為1時(shí)，單位體積發(fā)酵液中IAA含量；標(biāo)準(zhǔn)曲線由100μg/m L的分析純IAA標(biāo)準(zhǔn)液系列稀釋0，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg/m L，顯色方法同上，分光光度法測(cè)定OD530，以O(shè)D530為橫坐標(biāo)，IAA濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4溶磷菌株的鑒定溶磷菌的16S rRNA鑒定：對(duì)純化的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)）提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25μL體系：10×緩沖液2.5μL，Taq酶0.5μL，dNTPs2μL，引物27F 0.5μL，引物1492R 0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 18μL。反應(yīng)程序設(shè)定為95℃預(yù)變性5m in；94℃變性50 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5min，循環(huán)次數(shù)30次，72℃再延伸10m in，4℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海鉑尚生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

生理生化鑒定：將菌株接種到LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，對(duì)菌株進(jìn)行菌落形態(tài)描述，并根據(jù)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［22］對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色以及生理生化鑒定。

1.2.5模擬條件下JP6對(duì)土壤有效磷釋放的影響取250 g研磨過(guò)篩后的土于250m L三角瓶中，接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的JP6菌液，每瓶按18%接種量添加于上述三角瓶中混勻，調(diào)整土壤濕度為最大持水量的60%，然后用棉塞封閉三角瓶，在培養(yǎng)箱中25℃避光培養(yǎng)，每20 d取樣1次，測(cè)定土壤中有效磷含量，測(cè)定方法參照《土壤農(nóng)化分析》［23］。

1.2.6培養(yǎng)基優(yōu)化將活化好的菌種接種到LB培養(yǎng)基，37℃，190 r/m in，搖床培養(yǎng)10 h，制成種子液。

（1）單因子試驗(yàn)：最佳碳源的篩選：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入2%蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為碳源替代蔗糖50 g，按0.2%的接種量向培養(yǎng)基中接種種子液，37℃，190 r/min，搖床培養(yǎng)15 h，測(cè)定OD600的吸光值。

最佳有機(jī)氮源的篩選：在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入1%氮源（蛋白胨、酵母粉、豆餅粉作為氮源，碳源為最佳碳源，發(fā)酵條件同上。

最佳無(wú)機(jī)氮源的篩選：在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.5%的尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl作為無(wú)機(jī)氮源，同時(shí)加入相應(yīng)的最佳碳源和最佳有機(jī)氮源，發(fā)酵條件同上。

最佳無(wú)機(jī)鹽篩選：在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.3%的MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCO3作為無(wú)機(jī)鹽，同時(shí)加入相應(yīng)的最佳碳氮源，發(fā)酵條件同上。

（2）正交試驗(yàn)根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果，選取有利于菌體生長(zhǎng)的碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行正交試驗(yàn)。

確定最佳組合后，接種0.2%種子液，37℃，190 r/m in，培養(yǎng)24 h，采用稀釋涂布平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1溶磷菌的篩選

從土壤樣品中共分離得到15個(gè)具有溶磷功能的細(xì)菌分離物。選擇溶磷能力較好的一株細(xì)菌分離物標(biāo)記為JP6。JP6的溶磷圈直徑D為13mm，菌落直徑d為5.0mm，溶磷比D/d為2.6。JP6在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上的效果圖見(jiàn)圖1。

圖1　JP6在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上的溶磷圈Fig.1Phosphorus solubilizing halo of JP6 on inorganic phosphorusmedium

2.2功能測(cè)定

溶磷能力測(cè)定：利用鉬銻抗比色法對(duì)JP6菌株的溶磷能力進(jìn)行定量測(cè)定，測(cè)得28℃培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中的有效磷含量達(dá)到50.1mg/L。

產(chǎn)IAA能力測(cè)定：經(jīng)Salkowski顯色方法測(cè)得JP6菌株28℃在R2A培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d的發(fā)酵液中的IAA含量達(dá)到128.9μg/m L。

2.3JP6菌株鑒定

2.3.1生理生化實(shí)驗(yàn)JP6的菌體為短桿狀，菌體長(zhǎng)為6.5～8.7μm。經(jīng)革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)JP6菌株為革蘭氏陰性菌。JP6在LB固體培養(yǎng)基上的菌落特征為：圓形，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，凸起，易于挑取。JP6的部分生理生化指標(biāo)見(jiàn)表1。JP6與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）模式種的生理生化具有相同特征，由各項(xiàng)生理生化推斷JP6可能為陰溝腸桿菌。

表1　生理生化檢測(cè)Table 1 Physiologicaland biochem ical test

2.3.216s rRNA鑒定

圖2　JP6系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of JP6

對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)序后，將序列提交至GenBank中，獲得序列號(hào)（KU160628），在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)JP6菌株的16S rRNA序列與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（JQ038222.1）相似度為99%。由圖2系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出JP6菌株與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（JQ038222.1）同處最小的一個(gè)分支，進(jìn)化距離較近，綜合生理生化指標(biāo)將JP6菌株鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae）。

2.4模擬條件下JP6對(duì)土壤有效磷釋放的影響

圖3　有效磷含量隨天數(shù)變化Fig.3 Phosphorus content changesw ith the days

對(duì)照組CK和JP6組的模擬試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示：與初始土壤相比，前60 d土壤中的有效磷含量減少。60 d以后CK和JP6組的有效磷含量開始增加。其中CK組的土壤有效磷含量增加緩慢，JP6處理組在80 d時(shí)土壤有效磷含量高于CK，并且超過(guò)初始值。CK組在100 d和120 d時(shí)有效磷含量也高于初始值。與對(duì)照相比，JP6組80 d、100 d的有效磷含量分別增加2.16%、2.59%；120 d時(shí)，JP6組土壤中的有效磷含量在0.05水平上顯著高于CK組，與CK相比，JP6的有效磷含量增加9.84%。

2.5培養(yǎng)基優(yōu)化

2.5.1單因子試驗(yàn)

表2　碳源的優(yōu)化Table 2Optim ization of carbon source

根據(jù)發(fā)酵液在600 nm處的吸光度值可以對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)量做一個(gè)初步判斷。表2顯示不同碳源的OD600值大小為葡萄糖＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞玉米粉＞可溶性淀粉，所以JP6的最佳碳源為葡萄糖。

表3　氮源優(yōu)化Table 3Optim ization for nitrogen source

發(fā)酵15 h后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行OD600的測(cè)定，3種有機(jī)氮源的OD600值大小為：酵母粉＞豆粕＞蛋白胨，確定JP6的最佳有機(jī)氮源為酵母粉。由于JP6在酵母粉和豆餅粉中的生長(zhǎng)量相差不大，同時(shí)考慮到生產(chǎn)成本，所以選擇豆粕作為最佳有機(jī)氮源。

在無(wú)機(jī)氮源的選擇中發(fā)現(xiàn)NH4Cl的OD600值要高于（NH4）2SO4、尿素、NH4NO3，故此確定JP6的最佳無(wú)機(jī)氮源為NH4Cl。

表4　無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化Table 4Optim ization of inorganic salt

在確定最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上對(duì)無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，在豆芽汁培養(yǎng)基中分別加入0.3%的MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、CaCO3。對(duì)OD600的值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CaCO3＞KH2PO4＞K2HPO4＞MgSO4。由此可以看出JP6的最佳無(wú)機(jī)鹽為CaCO3。

2.5.2正交試驗(yàn)根據(jù)單因子試驗(yàn)確定的最佳碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源和無(wú)機(jī)鹽，選取葡萄糖（A），豆粕（B），NH4Cl（C），CaCO3（D）進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表5所示。

表5　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table5Orthogonalexperimentaldesign

表6　正交試驗(yàn)結(jié)果Table6 The resultsof orthogonalexperiment

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可以得出四種因素的極差值大小排列為RA＞RD＞RC＞RB（見(jiàn)表6），可以判斷影響發(fā)酵液中JP6菌體數(shù)量的主要因素是葡萄糖（A），其次為CaCO3（D）和NH4Cl（C），豆粕（B）影響最小。

根據(jù)正交試驗(yàn)所得的K值大小可以確定JP6的最佳培養(yǎng)基為在10%黃豆芽基礎(chǔ)上添加1.5%葡萄糖，2%豆粕，0.5%NH4Cl，0.5%CaCO3。利用最佳培養(yǎng)基，0.2%接種量，37℃，190 r/m in，培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中JP6活菌數(shù)達(dá)到7.55×109cfu/m L，而在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中活菌數(shù)為5.92×108cfu/m L，活菌數(shù)大幅度增加。

3　討論

本試驗(yàn)從取自湖南官地坪煙科所煙田的煙草根際土壤中分離篩選得到JP6菌株。經(jīng)形態(tài)和生理生化鑒定，以及16S rRNA測(cè)序?qū)P6鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。JP6菌株發(fā)酵液中的有效磷含量達(dá)到50.1mg/L，發(fā)酵液中的IAA含量達(dá)到128.9μg/m L。固體培養(yǎng)時(shí)，JP6菌株的溶磷比為2.6，而李明新報(bào)道的陰溝腸桿菌C-12［18］的溶磷比為2.0。C-12發(fā)酵液中有效磷含量為210.6mg/L，而JP6的發(fā)酵液中有效磷含量為50.1mg/L，這是由接種量不同導(dǎo)致的，試驗(yàn)中C-12進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)接種量為4%，JP6進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)接種量為1%。與李曉舉［17］、李明新［18］報(bào)道的陰溝腸桿菌相比，JP6還兼有產(chǎn)生長(zhǎng)素功能。在土壤模擬試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)土壤中有效磷含量在前期出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，可能原因是土壤進(jìn)行自然風(fēng)干處理，未進(jìn)行徹底滅菌，當(dāng)土壤的水分、培養(yǎng)溫度適宜時(shí)土壤微生物的休眠體（如芽孢）萌發(fā)，而休眠體萌發(fā)過(guò)程需要消耗土壤中的磷素，用于合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，前期出現(xiàn)下降。隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組的土壤有效磷含量出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，可能是因?yàn)橥寥乐写嬖诘木哂腥芰鬃饔玫奈⑸锶缪挎邨U菌會(huì)發(fā)揮溶磷功能［24］，能夠降解土壤中的難溶磷，引起土壤中有效磷含量的增加。JP6組的土壤有效磷含量在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中與CK組變化趨勢(shì)一致，但前60 d有效磷含量低于CK組，可能原因是接種JP6菌劑后，土壤中微生物的含量短時(shí)間內(nèi)大量增加，微生物為維持生命活動(dòng)消耗大量可溶性磷素，因此JP6土壤中有效磷含量比CK減少幅度大。在80 d后JP6組的土壤有效磷含量高于對(duì)照，推測(cè)原因是JP6具有溶磷功能，接種JP6后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間適應(yīng)土壤環(huán)境，開始加速土壤中難溶磷的分解。在120 d時(shí)，JP6組的有效磷含量與CK在0.05水平達(dá)到顯著差異，增加9.84%。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出兼有溶磷和產(chǎn)生長(zhǎng)素功能的陰溝腸桿菌JP6菌株，通過(guò)模擬試驗(yàn)驗(yàn)證JP6在土壤中具有較好的溶磷作用，試驗(yàn)中運(yùn)用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)兩種方法對(duì)JP6的液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基是在10%黃豆芽基礎(chǔ)上添加1.5%葡萄糖，2%豆粕，0.5%NH4Cl，0.5% CaCO3。利用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基能有效促進(jìn)陰溝腸桿菌JP6菌株的生長(zhǎng)，為陰溝腸桿菌JP6菌株下一步的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、工業(yè)化生產(chǎn)以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Isolation and Identification of Tobacco Rhizosphere Phosphate Solubilizing Bacteria and Optimization of Medium

LIU Hu1，HOU Zhen1，YIJian-hua2*，ZHOU Dong-bo2，ZHOU Shu-guang2，LIU Kai1，WANGCheng-qiang1，DINGYan-qin1，DU Bing-hai1*
1.CollegeofLifeSciences/Shandong AgriculturalUniversity；Shandong Key LaboratoryofAgriculturalMicrobiology，Taian271018，China
2.Research&DevelopmentCenterofChinaTobaccoHunan IndustrialCo.Ltd，Changsha410007，China

The phosphate-solubilizing bacterium was isolated w ith selectivemedium in this test.The strain was identified by 16S rRNA sequence analysis and biological characteristics including phosphate solubilization and IAA secretion.The capability of phosphate-solubilization and the production of IAA were detected by themethod of Mo-Sb colorimetry and Salkowski colorimetry.The effect of JP6 on available phosphorus in soil was verified by simulated experiments.The one factor test and the orthogonal testwere used for the optimization of a liquid culturemedium for Enterobacter cloacae JP6. The results showed that JP6 possessed the capacity of phosphate solubilization.The available phosphoruswas dissolved by JP6 as high as 50.1 mg/L in liquid culturemedium.IAA was secreted by JP6 as high as 128.9μg/m L in the R2A medium. With the culturalandmorphological characteristics，combined with 16s rRNA sequence analysis，the strain JP6was identified as Enterobacter cloacae.When the culturemedium containing 10%soybean sprouts，1.5%glucose，2%soybeanmeal，0.5% NH4Cl，and 0.5%CaCO3，the grow th of Enterobacter cloacae could increase significantly.It has a good role in dissolving phosphorus.Theoptimized culturemedium could promote thegrow th of JP6 effectively.

Phosphate-solubilizing bacteria；Enterobacter cloacae；isolation；identification；optimization ofmedium

S154.39

A

1000-2324（2016）04-0514-06

2016-04-19

2016-06-16

湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（2011-yc-0002）；山東省重大科技專項(xiàng)（2015ZDXX0502B02）

劉虎（1990-），男，山東臨沂人，在讀碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物學(xué).E-mail：liuhu20090905@163.com

Author for correspondence.E-mail：yijh0516@hngytobacco.com；du_binghai@163.com