緊密連接蛋白1和血管內皮生長因子C蛋白與大腸癌的關系研究*

李　燕，吳密璐，駱玉霜，劉志波，陳　蓉

(青海大學附屬醫院病理科，西寧 810000)

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緊密連接蛋白1和血管內皮生長因子C蛋白與大腸癌的關系研究*

李燕，吳密璐△，駱玉霜，劉志波，陳蓉

(青海大學附屬醫院病理科，西寧 810000)

目的探討緊密連接蛋白1(Claudin-1)與血管內皮生長因子C(VEGF-C)在大腸癌組織中的表達情況及二者間的相互關系。方法對該院病理科收集的50例大腸癌組織、癌旁組織及50例正常大腸組織采用免疫組織化學SP法檢測，根據患者的年齡、性別、是否發生淋巴結轉移、浸潤深度、臨床分期進行綜合比較，分析Claudin-1和VEGF-C蛋白在大腸癌組織中表達的相關性。結果大腸癌組織的Claudin-1、VEGF-C陽性率顯著高于癌旁組織和正常大腸組織(χ2=32.270，P=0.000；χ2=41.209，P=0.000)；癌旁組織的Claudin-1、VEGF-C陽性率顯著高于正常大腸組織(χ2=7.294，P=0.007；χ2=5.741，P=0.017)。大腸癌組織Claudin-1的表達與分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移具有密切關系(P<0.05)，大腸癌組織VEGF-C的表達與浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小具有密切關系(P<0.05)。大腸癌Claudin-1、VEGF-C表達具有顯著的正相關關系(χ2=10.953，P=0.001，r=0.468)。結論大腸癌組織的Claudin-1、VEGF-C表達顯著高于癌旁組織和正常大腸組織，大腸癌組織的Claudin-1、VEGF-C表達與臨床分期等因素具有一定的關系。

血管內皮生長因子；連接蛋白類；腸腫瘤

大腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，每年的發病率和病死率都在持續上升，50%～60% 的患者死于腫瘤復發和轉移[1]。腫瘤的發生、發展與轉移是一個復雜的、多步驟、多因素相互作用的動態過程，有研究顯示緊密連接蛋白1(Claudin-1)和血管內皮生長因子C(VEGF-C)在大腸癌組織中呈現高表達狀態，與腫瘤的發生、浸潤、淋巴轉移有關。Claudin-1對于維持上皮屏障結構的穩定性及細胞間物質交流具有重要作用；VEGF-C能誘導腫瘤外周形成新的淋巴管，使腫瘤細胞從新生淋巴管轉移[2]。本研究通過免疫組織化學方法檢測Claudin-1和VEGF-C在大腸癌組織、癌旁組織及正常大腸組織的表達情況，分析兩種蛋白與大腸癌的相關性，為大腸癌的診斷及預后評價提供參考，現將結果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料本研究選取本院病理科2013年3月至2014年12月收集的50例大腸癌組織、癌旁組織及50例正常大腸組織標本。納入標準：經病理確診并接受過放射、化學藥物治療的大腸癌組織；正常大腸組織經過病理組織學檢查排除癌變及其他相關病變，來源于腸鏡檢查排除腫瘤病變的患者。本次研究共納入150例標本，大腸癌組織組50例，男28例，女22例；年齡48～74歲，平均(58.4±7.2)歲；50例均為腺癌，其中結腸癌23例，直腸癌27例；分化程度：高分化18例，中分化21例，低分化11例；浸潤深度：漿膜層以內21例，漿膜層以下29例；淋巴結轉移22例，未轉移28例；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期6例。癌旁組織50例標本取自上述50例確診的大腸癌患者的癌旁組織。正常大腸組織50例，男32例，女18例；年齡44～76歲，平均(60.4±8.1)歲。3組標本上述一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑石蠟切片機 RM2235(德國 LEICA 公司)，OlympusBX51型電子顯微鏡(日本Olympus公司)，脫水機 ASP300S(德國 LEICA 公司)，包埋機 EG1150H(德國 LEICA 公司),Claudin-1 兔抗人多克隆抗體(博奧森 bs-1428R Rba),VEGF-C多克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司),免疫組織化學SP試劑盒(福州邁新生物有限公司)。

1.3檢測方法取患者的大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織浸泡于10%福爾馬林溶液固定24 h，對組織進行修塊，分別浸泡于70%乙醇3 h、80%乙醇3 h、90%乙醇3 h、100%乙醇Ⅰ3 h、100%乙醇Ⅱ3 h、二甲苯Ⅰ30 min、二甲苯Ⅱ30 min，在67 ℃恒溫中浸蠟30 min，包埋，修蠟塊。使用切片機進行連續4 μm切片，42 ℃展片，67 ℃烤片2 h，然后經過二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、100%乙醇Ⅰ 5 min、100%乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min，枸櫞酸鹽緩沖液92～98 ℃ 30 min進行抗原修復，然后根據免疫組織化學試劑盒說明書進行染色，顯微鏡下觀察并攝片，每張切片在400倍顯微鏡下選定10個視野計算陽性細胞的百分數，VEGF-C陽性物質呈棕黃色細顆粒狀，定位于胞質，Claudin-1陽性物質呈棕黃色細顆粒狀定位于胞質和包膜，陰性細胞數小于10%(-)，陽性細胞數大于或等于10%(+)。

2　結　　果

2.13種不同大腸組織中Claudin-1、VEGF-C表達情況大腸癌組織的Claudin-1、VEGF-C陽性率顯著高于癌旁組織和正常大腸組織(χ2=32.270，P=0.000；χ2=41.209，P=0.000)；癌旁組織的Claudin-1、VEGF-C陽性率顯著高于正常大腸組織(χ2=7.294，P=0.007；χ2=5.741，P=0.017)。見表1。

表1　　3種大腸組織中的Claudin-1、VEGF-C陽性率

2.2不同大腸癌臨床特征與Claudin-1、VEGF-C表達的關系大腸癌組織Claudin-1的表達與分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移具有密切關系(P<0.05)，大腸癌組織VEGF-C的表達與浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤最大徑具有密切關系(P<0.05)。見表2。

表2　　大腸癌不同臨床特征與Claudin-1、VEGF-C表達的關系

2.3大腸癌患者的Claudin-1、VEGF-C表達的相關關系大腸癌Claudin-1、VEGF-C表達具有顯著的正相關關系(χ2=10.953，P=0.001，r=0.468)，見表3。

表3　　大腸癌患者的Claudin-1、VEGF-C表達的相關性

χ2=10.953，P=0.001，r=0.468。

3　討　　論

腫瘤的發生是多因素、多基因參與的復雜過程，從基因水平探討大腸癌的發生發展規律、發病基礎，以及發病機制，將對大腸癌的診斷及治療提供重要依據。本研究通過對大腸癌組織中Claudin-1和VEGF-C的表達進行分析，初步闡明了二者在大腸癌發生發展中的作用。

Claudin-l屬于緊密連接蛋白家族，是Furuse于1998年發現的位于人染色體3q28-q29編碼21個氨基酸的基因[3]，其主要作用是參與細胞與細胞間的緊密連接，調控細胞間的物質交換[4]。有研究顯示，很多腫瘤的發生發展過程中Claudin-l表達異常，如大腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、胃腺癌等[5]。很多研究顯示，結腸癌組織中Claudin-1呈現過表達狀態，但是Claudin-1表達上調的意義尚不明確。Wnt 和Notch信號通路在正常結腸的發育過程中具有重要作用，Claudin-1是Tcf/Lef信號的靶分子，也是Wnt 和Notch信號通路的啟動環節，結腸癌組織中Claudin-1的高表達導致Wnt 目標基因上調，如原癌基因、cyclin D1和c-myc等，對于腫瘤的發生具有重要作用。本研究結果顯示，大腸癌組織中Claudin-l的表達水平高于癌旁組織和正常大腸組織，提示Claudin-1表達的位置與量的異常促成了腫瘤的發生。隨著大腸癌的發展，膜蛋白Claudin-1表現出自細胞膜向細胞質轉移的趨勢，作為細胞與外界溝通橋梁的細胞膜發生改變，導致細胞內外信息傳遞異常，從而引起腫瘤發生轉移。同時本研究結果顯示Claudin-1表達與大腸癌的分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結轉移具有密切關系，可能的機制為Claudin-1過表達可能抑制E-Cadherin的表達，上調β-Cadherin/Tcf信號通路，最終導致腫瘤發生發展，或者Claudin-1過表達誘導金屬基質蛋白酶2(MMP2)表達，使正常細胞具有侵襲能力，從而促進腫瘤轉移。有研究顯示APC Min 結腸癌模型小鼠的生存期限較健康鼠明顯降低，可能與Claudin-1過表達有關，與本研究結果有相似性[6]。

VEGF-C屬血管內皮生長因子和血小板生長因子家族，是Jeltsch等1997年發現的位于人類染色體的4q34編碼119個氨基酸的基因[7]，是第一個報道的淋巴增長刺激因子，可以調節淋巴內皮細胞的增殖和分化，促進腫瘤淋巴結轉移，VEGF-C的異常表達與食管癌的不良預后有關，被認為是預測淋巴結轉移的有效指標[8]。很多研究中顯示VEGF-C的表達是淋巴結轉移、遠處轉移和預后不良的象征[9]。本研究顯示VEGF-C在大腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織和正常大腸組織，提示VEGF-C在大腸癌的發生過程中具有重要作用，與大腸癌的浸潤、分期、淋巴轉移有關；可能原因是VEGF-C由癌組織產生后，通過自分泌和旁分泌的形式與VEGFR-3結合，通過MEK/ERK及PI3K激酶/AKT途徑誘導內皮細胞增殖和遷移從而導致腫瘤淋巴管和血管的新生，改變腫瘤胞外基質的黏附性，促進腫瘤的轉移浸潤[10]。

本研究對Claudin-1和VEGF-C的表達進行了相關性分析，結果顯示二者表達具有明顯的正相關關系，即隨著大腸癌分化程度的升高，Claudin-1和VEGF-C的表達逐漸降低，Ⅲ+Ⅳ期患者的陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴結轉移的患者二者的表達高于未出現淋巴結轉移的患者，提示Claudin-1和VEGF-C的表達均與大腸癌的分化、轉移、分期等有關，因此對Claudin-1和VEGF-C的表達進行分析可以為大腸癌患者預后和生存判斷提供重要依據。

綜上所述，大腸癌組織中Claudin-1和VEGF-C呈現高表達狀態，與腫瘤的分化、轉移、分期具有密切聯系，而且Claudin-1和VEGF-C的表達水平呈正相關，Claudin-1和VEGF-C兩基因參與了大腸癌的發生發展過程，是腫瘤轉移基因，促進腫瘤的發生和轉移。對大腸癌患者的Claudin-1和VEGF-C表達水平進行檢測，可以作為大腸癌患者診斷、生存及預后評價的參考指標。

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Relationship of Claudin-1 and VEGF-C protein with colorectal cancer

LiYan,WuMilu△,LuoYushuang,LiuZhibo,ChenRong

(DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of tight junction protein 1(Claudin-1) and vascular endothelial growth factor C(VEGF-C) in colorectal carcinoma tissues and the relationship between them.MethodsTotally 50 cases of colorectal carcinoma,paracancerous tissues and 50 cases of normal colorectal tissues from Department of Pathology were detected by immunohistochemistry SP method,according to the patient′s age,gender,lymph node metastasis,depth of invasion,clinical stage for comprehensive comparison,and analyze the Claudin 1 and VEGF-C protein expression in colorectal cancer tissues.ResultsThe positive rates of Claudin-1,VEGF-C in colorectal cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous tissue and normal colorectal tissues (χ2=32.270,P=0.000;χ2=41.209,P=0.000),the positive rate of Claudin-1,VEGF-C in paracancerous cancer tissues was significantly higher than that in normal colorectal tissues (χ2=7.294,P=0.007;χ2= 5.741,P=0.017).The expression of colorectal carcinoma Claudin-1 had close relationship with differentiation,invasion degree,TNM stage,lymph node metastasis(P<0.05),the expression of VEGF-C had colse relatons with infiltration degress,TNM stage,lymph node metastasis,tumor size(P<0.05).The expression of colorectal cancer Claudin-1,VEGF-C had significantly positive correlation (χ2=10.953,P= 0.001,r=0.468).ConclusionThe expression of colorectal cancer Claudin-1,VEGF-C was significantly higher than that in paracancerous tissue and normal colorectal tissue,the expression of Claudin-1,VEGF-C had a certain relationship with clinical staging.

vascular endothelial growth factor;connexins;intestinal neoplasms

李燕(1980-)，主治醫師，本科，主要從事腫瘤內科相關專科如肺癌或消化道腫瘤等研究。△

， E-mail:bgthsr@163.com。

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.014

R735.3

A

1671-8348(2016)07-0909-03

2015-09-10

2015-11-20)