生理性深層海水聯(lián)合熱療治療肝細(xì)胞癌的體外抑瘤研究*

代佑果,李為明,唐輝蓉,姚　乾,崔　進(jìn)△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院，昆明 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

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論著·臨床研究

生理性深層海水聯(lián)合熱療治療肝細(xì)胞癌的體外抑瘤研究*

代佑果1,李為明2,唐輝蓉2,姚乾1,崔進(jìn)2△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院，昆明 650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

目的探討生理性深層海水(PDSW)聯(lián)合熱療對(duì)肝細(xì)胞癌的體外抑瘤作用。方法將取自我國(guó)海南省海域的深層海水進(jìn)行制備，制成PDSW，檢測(cè)所含有的部分元素。體外培養(yǎng)的正常肝細(xì)胞和人肝癌QGY-7703細(xì)胞被隨機(jī)分為PDSW組和生理鹽水組，PDSW組加入PDSW，生理鹽水組給予等量生理鹽水，24 h后，每天分別接受40 ℃熱療6 h和43 ℃熱療1 h，在熱療后的24、48、72 h，用MTT法檢測(cè)熱療結(jié)合PDSW對(duì)正常肝細(xì)胞及人肝癌QGY-7703細(xì)胞的抑制率。同時(shí)檢測(cè)PDSW及生理鹽水在40 ℃ 6 h連續(xù)10 d狀態(tài)下對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞克隆形成率的影響。結(jié)果MTT檢測(cè)結(jié)果顯示腫瘤抑制率在兩組均呈時(shí)間和濃度依賴性。PDSW組的腫瘤抑制率明顯較生理鹽水組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PDSW組對(duì)正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯低于生理鹽水組。此外，PDSW組的腫瘤細(xì)胞克隆形成率較生理鹽水組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)DSW能夠提高正常肝細(xì)胞對(duì)熱的耐受性。當(dāng)聯(lián)合熱療時(shí)，可明顯抑制人肝癌QGY-7703細(xì)胞生長(zhǎng)。

癌，肝細(xì)胞；生理性深層海水；熱療；耐受力

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1深層海水取自海南省瓊海市海域，海平面200 m以下，避光運(yùn)至昆明，室溫避光儲(chǔ)存。在0.3 MPa壓力下，經(jīng)5.00 μm、1.00 μm聚丙烯熔噴PP棉超微過(guò)濾后，用銅鋅合金(KDF)除去海水中的重金屬，反復(fù)凍融方法濃縮并去除海水中多余的鹽分濃縮海水，0.01 μm PVC合金超濾膜除細(xì)菌、部分病毒和微小雜質(zhì)，活性炭吸附異味，電感耦合等離體質(zhì)鐠(ICP-MS)多次檢測(cè)PDSW中部分元素的含量后，制備成PDSW備用。

1.1.2細(xì)胞株人肝癌QGY-7703細(xì)胞株由云南省腫瘤研究所提供。正常肝細(xì)胞由云南省腫瘤研究所提供。

1.1.3主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；新生小牛血清為美國(guó)Costar公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉(SDS)、二甲基酰胺(DMF)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；MTT：美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞抑制率檢測(cè)(改良MTT比色法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞株及正常肝細(xì)胞株經(jīng)0.25%胰酶消化，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。然后進(jìn)行分組,每組設(shè)6個(gè)平行孔，其中空白對(duì)照組:只加培養(yǎng)基；對(duì)照組:培養(yǎng)細(xì)胞，不加藥；試驗(yàn)組：海水終濃度梯度為100%(即PDSW)、50.00%、25.00%、12.50%、8.33%、6.25%；陽(yáng)性對(duì)照組：鹽水終濃度梯度為0.90%、0.45%。上述各組再根據(jù)熱療溫度不同設(shè)37 ℃、40 ℃及43 ℃ 3個(gè)組，每組根據(jù)熱療時(shí)間(次數(shù))再分為24 h(熱療1次)、48 h(熱療2次)、72 h(熱療3次)3個(gè)組。熱療：其中一組每天把培養(yǎng)箱的溫度提高到40 ℃，持續(xù)6 h后，再把培養(yǎng)箱的溫度恢復(fù)到37 ℃；另一組每天把培養(yǎng)箱的溫度提高到43 ℃，持續(xù)1 h后，再把培養(yǎng)箱的溫度恢復(fù)到37 ℃。37 ℃組按常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。終止熱療作用：分別在熱療后的24、48、72 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20.00 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。各孔加入20% SDS 50% DMF裂解液溶解甲瓚結(jié)晶，震蕩后過(guò)夜。用酶標(biāo)儀于580 nm測(cè)定光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖情況。

1.2.2癌細(xì)胞克隆形成率檢測(cè)每試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)3復(fù)孔(24孔板)，每孔接種2×102個(gè)人肝癌QGY-7703細(xì)胞，24 h后分別加入生理鹽水(NS)或PDSW。每3天換液。連續(xù)觀察7～10 d，計(jì)數(shù)各孔克隆數(shù)(細(xì)胞數(shù)大于或等于50判定為克隆)。克隆形成率(%)=克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%，計(jì)算各孔克隆形成率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間對(duì)比采用單因素方差分析，兩兩對(duì)比采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1加PDSW或NS進(jìn)行37 ℃常規(guī)培養(yǎng)對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制作用 37 ℃正常培養(yǎng)狀態(tài)下，加PDSW或NS對(duì)正常肝細(xì)胞均沒(méi)有明顯的抑制作用，24、48、72 h各時(shí)段兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1　37 ℃常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，加PDSW或NS對(duì)正常肝 細(xì)胞增殖的抑制率

2.2加PDSW或NS分別進(jìn)行40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h熱療對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的平均抑制率40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h加NS或PDSW對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的平均抑制率均呈時(shí)間依賴性(圖2)，即隨著熱療時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率也隨著增加；且加NS的抑制率較加PDSW者明顯。

2.3同一溫度下，PDSW組及NS組對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制率在同一溫度(40 ℃或43 ℃)下，各時(shí)間點(diǎn)，PDSW組對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制率均較NS組小(P<0.05)。就PDSW組來(lái)說(shuō)，40 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4同一時(shí)間、同一溫度，不同濃度海水對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制率同一時(shí)間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)熱療時(shí)，各組隨著海水濃度增加，抑制率增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴的特點(diǎn)，即隨著海水濃度增大，PDSW加熱療對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制率增強(qiáng)。未被稀釋的PDSW(即海水原液：硬度為3 000 ppm的深層海水)組的抑制率最強(qiáng)，見(jiàn)圖4。

圖2　不同時(shí)間、不同溫度，加PDSW和NS對(duì) 正常肝細(xì)胞增殖的抑制率

圖3　同一溫度下，PDSW組及NS組對(duì)正常 肝細(xì)胞增殖的抑制率

圖4　同一時(shí)間、同一溫度，不同濃度海水對(duì)正常 肝細(xì)胞增殖的抑制率

2.5同一時(shí)間、同一溫度下，加NS與PDSW(海水原液)對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的影響同一時(shí)間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)下，在體外，PDSW加熱療對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制率均低于NS(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5　同一時(shí)間、同一溫度下，加NS與PDSW 對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的抑制率

2.6加PDSW或NS進(jìn)行37 ℃常規(guī)培養(yǎng)對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制作用在37 ℃正常培養(yǎng)狀態(tài)下，加PDSW對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，24、48、72 h各時(shí)段與NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6　37 ℃常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，加PDSW或NS對(duì)人肝癌 QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率

2.7加PDSW或NS分別進(jìn)行40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h熱療對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的平均抑制率40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h加NS或PDSW對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的平均抑制率呈時(shí)間依賴性(圖7)，即隨著熱療時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率也隨著增加；且PDSW組的抑制率較NS組明顯。

圖7　不同時(shí)間、不同溫度，加NS和PDSW對(duì)人肝癌 QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率

2.840 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h熱療比較，加NS組或PDSW組的各時(shí)段對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的影響40 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h熱療比較，加NS組或PDSW組的各時(shí)段的抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖8。

圖8　40 ℃ 6 h與43 ℃ 1 h熱療比較，加NS組 或PDSW組的各時(shí)段對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌 QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率

2.9同一時(shí)間、同一溫度，不同濃度的深層海水對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率同一時(shí)間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)熱療時(shí)，各組隨著海水濃度增加，抑制率增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴的特點(diǎn)，即隨著海水濃度增大，PDSW加熱療對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率增強(qiáng)。PDSW(即海水原液)組的抑制率最強(qiáng)，見(jiàn)圖9。

2.10同一時(shí)間、同一溫度下，加NS與PDSW(海水原液)對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的影響同一時(shí)間(24、48、72 h)、同一溫度(40 ℃或43 ℃)下，在體外，PDSW加熱療對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率均高于NS加熱療(P<0.05)，見(jiàn)圖10。

圖9　同一時(shí)間、同一溫度，不同濃度海水對(duì)人肝癌 QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率

圖10　同一時(shí)間、同一溫度下，加NS與PDSW對(duì)人肝癌 QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率

2.11同一時(shí)間、同一溫度，加PDSW對(duì)正常肝細(xì)胞和人肝癌QGY-7703細(xì)胞增殖的影響從總體上看，PDSW加40 ℃ 6 h或43 ℃ 1 h熱療在24、48、72 h均可以對(duì)肝癌QGY-7703細(xì)胞起到較好的抑制作用，同時(shí)對(duì)正常肝細(xì)胞產(chǎn)生較小的影響，見(jiàn)圖11。

圖11　同一時(shí)間、同一溫度，加海水對(duì)正常肝細(xì)胞和人肝癌 QGY-7703細(xì)胞增殖的抑制率

2.12PDSW對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞克隆形成率的抑制作用經(jīng)過(guò)10 d培養(yǎng)，PDSW組人肝癌QGY-7703細(xì)胞克隆形成較少(圖12A)，而在NS克隆形成明顯(圖12B)。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，40 ℃ 6 h熱療10 d后各組克隆形成率比較，PDSW組的克隆率明顯較NS組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

A:NS組；B：PDSW組。

圖12　加NS或PDSW 40 ℃ 6 h熱療10 d后，人肝癌 QGY-7703細(xì)胞克隆形成情況 表1　　40 ℃ 6 h熱療10 d后兩組各培養(yǎng)孔 腫瘤細(xì)胞克隆形成率(n=3)

3　討　　論

原發(fā)性肝癌是我國(guó)比較常見(jiàn)的惡性腫瘤,其惡性程度較高,起病隱匿,早期多無(wú)明顯癥狀，一旦發(fā)現(xiàn),大多已屬中晚期,目前缺乏有效的治療藥物。因而,為中晚期原發(fā)性肝癌患者尋找行之有效的治療方法已成為醫(yī)療界最緊迫的任務(wù)之一。熱療可以抑制腫瘤血管形成及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[3]，正逐漸成為一種有希望的肝癌治療手段。

體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生存率會(huì)隨著加熱的溫度和時(shí)間而變化,溫度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，療效將呈指數(shù)性遞增[4-5]。根據(jù)癌細(xì)胞對(duì)熱的臨界溫度(或稱為閾溫度)不同，熱可以發(fā)揮兩方面的作用，在閾溫度以下熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為熱作用的主要機(jī)制,而閾溫度以上則主要引起細(xì)胞壞死,細(xì)胞損傷程度呈指數(shù)性遞增[6-7]。細(xì)胞株的種類不同，閾溫度也不一樣,差異頗大,一般認(rèn)為大多數(shù)細(xì)胞株的臨界溫度介于42.5～43.0 ℃。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同一組別(NS組或PDSW組)，40 ℃ 6 h的熱療對(duì)人肝癌QGY-7703細(xì)胞的抑制率與43 ℃ 1 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明提高熱療的溫度或延長(zhǎng)作用時(shí)間，均可增加熱療的細(xì)胞毒作用，從而可為溫和熱療[平臺(tái)期生物體核心溫度(39.8±0.2)℃，恒溫期6 h]治療腫瘤奠定基礎(chǔ)，在溫和熱療作用下，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，可以達(dá)到高溫?zé)岑熗瑯拥男Ч?/p>

內(nèi)環(huán)境的維持靠各種微量元素的平衡，只有在穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境下，機(jī)體的功能才能正常發(fā)揮。海水是為人類提供“平衡微量元素”的最好資源[7]。與表層海水比較，深層海水具有以下特點(diǎn)：低溫、潔凈性、富含平衡易吸收的微量元素、氧化還原水、pH值呈弱堿性[8]。飲用深層海水可糾正元素異常，恢復(fù)患者的鈣(Ca)/鎂(Mg)比例，以及鋁(Lv)、汞(Hg)和鉛(Pb)水平[9]。長(zhǎng)期飲用深層海水可促進(jìn)機(jī)體的元素平衡，如其中的鈉(Na)和鉀(K)均衡有助于維持機(jī)體的酸堿平衡[10]；Ca和Mg比例的適當(dāng)對(duì)調(diào)節(jié)脂代謝及維持心血管系統(tǒng)的正常功能尤為重要[11-12]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入PDSW，正常肝細(xì)胞對(duì)熱的臨界溫度提高，耐熱能力增強(qiáng)，而肝癌QGY-7703細(xì)胞的臨界溫度相反降低，耐熱能力降低。推測(cè)由于癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常(如Na+-K+ATP等異常)，即使在給予平衡元素的基礎(chǔ)上也難以糾正自身的元素失衡，造成對(duì)熱耐受力降低，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

此外，深層海水具有直接抑制腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移的作用，Kim等[13]的研究表明PDSW對(duì)乳腺癌的侵襲/轉(zhuǎn)移具有抑制作用，由此認(rèn)為PDSW通過(guò)預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移，有望改善癌癥患者的生存。本研究發(fā)現(xiàn)在37 ℃正常培養(yǎng)狀態(tài)下，PDSW對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌QGY-7703細(xì)胞的增殖能力具有明顯的抑制作用，且這種抑制具有時(shí)間及濃度依賴的特點(diǎn)，其抑制機(jī)制推測(cè)可能與Kim等報(bào)道的結(jié)果類似，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。

總之，本研究結(jié)果表明PDSW能夠提高正常肝細(xì)胞對(duì)熱的耐受性。在正常體溫(37 ℃)狀態(tài)下，PDSW對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌QGY-7703細(xì)胞的增殖能力具有明顯的抑制作用。當(dāng)與熱療聯(lián)合使用時(shí)，PDSW能夠改變癌細(xì)胞對(duì)熱的臨界溫度，增加熱療的抗癌效果，相關(guān)機(jī)制需要更多研究支持。

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The anti-cancer effects of physiological deep-sea water combined with hyperthermia for hepatocellular carcinoma in vitro*

DaiYouguo1,LiWeiming2,TangHuirong2,YaoQian1,CuiJin2△

(1.theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity/TumorHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650118,China;2.theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650101,China)

ObjectiveTo explore the anti-cancer effects of physiological deep-sea water(PDSW) combined with hyperthermia for hepatocellular carcinoma in vitro.MethodsDeep-sea water (DSW) from the south Chinese sea was processed,and made into PDSW,detection of some elements.In vitro,the cultured normal liver cells and human hepatoma QGY-7703 cells were randomly divided into PDSW group and normal saline(NS) group,the NS group received saline,the PDSW group received different concentrations of PDSW.Two groups were heated respectively to 6 h of 40 ℃ or 1 h of 43 ℃，24,48,72 h after the administration of PDSW or saline,the normal liver cells and QGY-7703 cells proliferation capacity and toxicity were investigated by MTT assay.At the same time testing PDSW and NS in 40 ℃ 6 h for 10 d state of human liver QGY-7703 cell clone formation rate.ResultsThe results of MTT assay showed that tumor inhibitory rate were time and concentration dependent in tow groups.Tumor inhibitory rate of PDSW group in different time was significantly higher than NS group (P<0.05).On the other hand,the inhibitory of hepatocyte for PDSW group in different time were significantly lower than NS group.In addition,the clone formation rate of PDSW group was lower than those of NS group(P<0.05).ConclusionPDSW can improve the heat tolerance of normal liver cells.When combine with heat,it can obviously inhibit the growth of human liver cancer QGY-7703 cells.

carcinoma，hepatocellular;deep-sea water;hyperthermia;tolerance

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.011

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2010CD166)。作者簡(jiǎn)介：代佑果(1978-)，副教授，博士，主要從事肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究。△

，E-mail:yncuijin@126.com。

R282.77

A

1671-8348(2016)07-0899-04

2015-09-08

2015-11-22)