微電場對滋養細胞遷移/侵襲相關MMPs/TIMPs表達的影響*

張　娟，李明勇，賀　元，白　懷，范　平

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都 610072；2.四川大學華西第二醫院/西部婦幼醫學研究院，成都 610041)

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·論著·

微電場對滋養細胞遷移/侵襲相關MMPs/TIMPs表達的影響*

張娟1，李明勇1，賀元1，白懷2，范平2

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都 610072；2.四川大學華西第二醫院/西部婦幼醫學研究院，成都 610041)

目的探討生理性微電場對體外培養的人胎盤滋養細胞遷移/侵襲相關分子金屬基質蛋白酶(MMPs)/組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)表達的影響。方法用150 mV/mm的直流微電場刺激滋養細胞，測定其遷移情況并觀察形態變化。實時熒光定量PCR和Western blot檢測刺激前后MMP2、MMP9和TIMP1、TIMP2基因和蛋白表達水平。結果未加電刺激的滋養細胞，其運動緩慢，遷移方向隨機；在含有10%小牛血清的培養基中，150 mV/mm電場刺激下滋養細胞向負極遷移，遷移速度和距離明顯增加(P<0.01)，胞體拉長，垂直于電場方向排列。電場刺激后，胞內MMP2 mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，MMP9、TIMP1和TIMP2表達水平無明顯變化。結論生理性直流微電場可介導滋養細胞定向遷移和排列，MMP2表達水平的上調可能與微電場促進滋養細胞遷移/侵襲功能有關。

滋養細胞；金屬基質蛋白酶;組織抑制因子;遷移;侵襲；電場

人類滋養細胞是一群特殊的細胞，源于胚胎期的胚外層。在受精卵種植的7～8 d，胚外層細胞分化，形成原始滋養細胞，于受精后2周左右該群細胞形成絨毛的初始結構。此后，滋養細胞進一步分化為無侵襲能力的絨毛滋養層細胞(villous trophoblasts,VTs)和有侵襲能力的絨毛外滋養層細胞(extravillous trophoblasts，EVTs) 兩部分。滋養細胞侵襲功能的破壞會引起胎盤功能障礙，導致多種產科疾病如流產、子癇前期和胎兒宮內生長受限等。

滋養細胞浸潤主要由以下過程組成：蛋白酶水解、周圍基質降解、組織重建等，這個過程具有嚴格的時間和空間調控特性[1]。金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs) 是胚胎植入過程中降解細胞外基質主要的蛋白酶，MMPs按其作用底物的不同分為4類：膠原酶、明膠酶(MMP2、MMP9)、基質分解素和膜型MMPs。其中，MMP2是所有MMPs中分布最廣的成員，由多種細胞以無活性的酶原形式分泌，可被蛋白酶和有機汞制劑等激活，也可被同時活化的MMPs活化[2]。MMP9的分子量在MMPs家族中最大，由巨噬細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞和滋養細胞等多種細胞分泌。MMP2和 MMP9的主要功能是降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原和明膠，是迄今報道最多的兩種與滋養細胞遷移/侵襲功能相關的MMPs。

MMPs是胚胎植入過程中降解細胞外基質主要的蛋白酶，該酶的生物學活性受到其組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的抑制[2-3]。目前，控制絨毛外滋養細胞浸潤的分子機制目前還不清楚，迄今報道較多的主要是化學因子的作用，如細胞因子、生長因子、激素和細胞外基質糖蛋白以及多種轉錄因子等。這些因子可通過調控MMPs/TIMPs表達而促進妊娠滋養細胞的遷移/侵襲功能，但微電場對滋養細胞功能的影響是否與MMPs/TIMPs的表達有關仍不清楚。

生物電現象是生命活動的基本屬性，在機體的一切生命活動中都伴隨著生物電的產生[4]。作者前期的研究工作發現[5-6]，微電場中培養的滋養細胞能產生定向運動的應答反應，提示微電場可能作為一種重要信號促進滋養細胞的遷移等功能。因此，推測微電場對滋養細胞遷移的影響可能通過對遷移/侵襲相關的重要蛋白酶MMPs及其抑制分子TIMPs的表達的調節來實現。因此，本實驗擬研究微電場刺激對滋養細胞遷移/侵襲相關MMPs/TIMPs表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑人胎盤滋養細胞HTR-8/Svneo由四川大學華西第二醫院彭冰教授惠贈。RPMI-1640培養基(GIBCO)，加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100μg /mL)，臨用前加入終濃度為10%的胎牛血清(GIBCO)。MMP2抗體、MMP9(G657) 抗體、TIMP2 (H-140)抗體、TIMP1 (N1C3) 抗體均購自Cell Signaling公司， Paxillin (N-term) 抗體、Paxillin Phospho (pY118) 抗體購自博士德公司。FITC-Phalloidin和DAPI均購自Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1滋養細胞的培養及加電滋養細胞以RPMI-1640在5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，培養基含有20%的小牛血清、0.04 mmol/L的谷氨酰胺、青霉素104 U/L、鏈霉素100 mg/L。每次實驗前24 h將凍存的細胞復蘇后以5×103個細胞/cm的密度接種于預制的細胞培養槽中，該培養槽由2片24 mm×22 mm、平行放置、相距10 mm的蓋玻片通過硅酮膠(Dow Corning)固定于100 mm×20 mm的組織培養皿的底面而形成一個兩端開放的細胞培養小室。對培養小室內細胞電場刺激后，收集細胞，用RIPA裂解，提取蛋白，常規Western blot方法檢測胞內相關信號通路蛋白的活化水平。

1.2.2實時熒光定量PCR總RNA的提取加電完成后取出細胞培養皿，棄培養基，冷PBS清洗，加入1 mL Trizol，反復吹打，將裂解液轉入DEPC處理過的Eppendorf管，室溫靜置10 min；加入氯仿(200 mL/1 mL Trizol)，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃離心，12 000 g×15 min，小心移取上層水相(0.45 mL)至另一1.5 mL Eppendorf管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4 ℃離心，12 000 g×10 min，棄上清，加入DEPC水配制的75%乙醇1 mL洗滌沉淀，4 ℃離心，12 000 g×10 min，棄上清，離心后的沉淀置于室溫干燥5 min，加入30 μL DEPC水，必要時55 ℃孵育10 min以利于RNA沉淀的溶解，核酸蛋白分析儀檢測RNA含量與純度。測得A260/280在1.8～2.0，含量大于 0.4 g/L，電泳28 S/18 S≥2，示RNA樣本達到要求。再根據Fermentas實時熒光定量試劑盒說明操作，將RNA逆轉錄成cDNA。擴增MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1、GAPDH的引物,見表1。

1.2.3Western blotWestern blot檢測采用常規方法，收集細胞，用RIPA裂解細胞提取總蛋白質，BCA法測定蛋白濃度，確定上樣量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行凝膠電泳，蛋白轉移至硝酸纖維素膜。分別與MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、p-FAK、FAK、p-Paxillin、Paxillin、GAPDH蛋白抗體及二抗反應后化學發光顯色，陽性條帶以凝膠吸光度分析軟件測定積分吸光度值為其蛋白量。

表1　　實時熒光定量PCR引物序列

2　結　　果

2.1微電場對滋養細胞遷移行為的影響研究結果顯示，在含有10%胎牛血清的培養基中，在150 mV/mm的直流電場刺激下，滋養細胞向負極定向遷移，電刺激10 h后，滋養細胞胞體拉伸，胞內骨架蛋白F-actin垂直于電場方向排列如圖1(10 h) 所示，未加電場刺激的細胞未發生上述反應，如圖1(0 h) 所示。滋養細胞在電場作用下向負極定向遷移，且遷移距離和遷移速度明顯高于未加電場刺激的對照組[5](P=0.021)。

A：0 h;B:10 h。

圖1滋養細胞在電場中向負極定向遷移，垂直于電場方向排列

2.2微電場刺激對滋養細胞MMPs/TIMPs表達的影響

2.2.1微電場對滋養細胞MMP2/TIMP2表達的影響實時熒光定量PCR結果顯示，150 mV/mm微電場刺激5、10 h，與未加電場刺激的細胞(0 h)相比較，MMP2 mRNA表達水平逐漸增加，分別為0 h的1.16倍和1.35倍，差異有統計學意義(P=0.042)，見圖2A；MMP2 蛋白表達水平逐漸增加，分別為0 h的1.46倍和1.77倍，差異均有統計學意義(P=0.039;P=0.026)，見圖2B。TIMP2是MMP2的生理性抑制劑。實時熒光定量PCR結果顯示，150 mV/mm微電場刺激滋養細胞5、10 h，與未加電場刺激的細胞(0 h)相比較，TIMP2 mRNA表達水平降低，分別為0 h的0.81倍和0.85倍，見圖3A；TIMP2 蛋白表達水平變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3B。

2.2.2微電場對滋養細胞MMP9/TIMP1表達的影響實時熒光定量PCR結果顯示，150 mV/mm微電場刺激滋養細胞5、10 h，與未加電場刺激的細胞(0 h)相比較，MMP9 mRNA表達水平無明顯改變，見圖4A；MMP9 蛋白表達水平也無明顯改變，見圖4B。TIMP1是MMP9的生理性抑制劑。實時熒光定量PCR結果顯示，150 mV/mm微電場刺激5、10 h，與未加電場刺激的細胞(0 h)相比較，TIMP1 mRNA表達無明顯改變，見圖5A；TIMP1蛋白表達水平降低，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5B。

圖2　微電場刺激促進滋養細胞MMP2基因和 蛋白的表達的影響

圖3　微電場刺激對滋養細胞TIMP2基因 和蛋白表達的影響

圖4　微電場刺激對滋養細胞MMP9基因和 蛋白表達的影響

圖5　微電場刺激對滋養細胞TIMP1基因和 蛋白表達的影響

2.3微電場對滋養細遷移相關FAK分子及下游Paxillin磷酸化的影響

2.3.1微電場對滋養細胞FAK磷酸化活性的影響[6]在150 mV/mm微電場作用下，FAK Tyr397位點于5 min內就已開始出現明顯磷酸化水平，10 min繼續加強(P=0.030)，30 min達到較高磷酸化水平(P=0.020)，60 min仍維持在較高水平(P=0.001)。總的FAK水平無明顯改變，結果見圖6。對FAK Tyr576/577位點磷酸化水平影響不如FAK Tyr397位點明顯(結果未顯示)。

圖6　　微電場刺激促進滋養細胞FAK Tyr397位點磷酸化

2.3.2微電場對滋養細胞Paxillin磷酸化的影響在相關信號傳導通路中，Paxillin位于FAK分子的下游，受FAK活化信號的激活。Western blot結果顯示，Paxillin在150 mV/mm微電場刺激細胞5 min和10 min出現磷酸化，30 min后磷酸化水平進一步升高(P=0.03)，60 min達較高水平(P=0.02)，Paxillin總蛋白表達水平無明顯改變，結果見圖7。

圖7　　微電場刺激促進滋養細胞Paxillin 磷酸化

3　討　　論

生理狀態下，妊娠胚胎植入早期，EVTs侵入蛻膜組織和子宮螺旋動脈，并使后者發生改建變成低阻、高容量血管，維持足夠的母體血液流入絨毛間支持胎盤的功能。EVTs適度地侵入子宮內膜是維持妊娠和胎兒發育的前提條件。EVTs侵入不足所致的胎盤缺血缺氧，可導致異常產科結局如流產、子癇前期和胎兒宮內生長受限等的發生。研究顯示，滋養細胞適度侵入與MMPs/TIMPs的表達以及妊娠滋養細胞疾病 (gestational trophoblastic disease，GTD)密切相關[7]。

滋養細胞侵入子宮內膜由黏附、定植、降解細胞外基質等環節構成。其中蛋白酶的降解是滋養細胞侵入的關鍵環節。MMPs是參與細胞外基質降解的主要蛋白酶類。其中MMP2和MMP9是其最重要成員，它們通過降解細胞基底膜Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、層粘連蛋白(laminin,LN)、彈性蛋白(elastin,EN)、蛋白聚糖(proteoglycans)和明膠(gelatin)等，促進滋養細胞的侵襲功能。研究報道顯示，一系列的化學因子可以調控MMPs的表達，并且能影響滋養細胞的重要功能[8-13]，如白血病抑制因子(LIF)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉化生長因子(TGF-β)、白介素1和6(IL-1和IL-6)、胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP-1)、AP-1轉錄因子以及滋養細胞分泌的人絨毛膜促性腺激素和leptin等，均能顯著影響MMP2和MMP9的分泌和(或)活性。這些細胞因子主要是通過對轉錄因子磷酸化水平的作用而對細胞的行為產生影響。本研究結果顯示，微電場可促進滋養細胞的定向遷移和垂直于電場方向排列，促進滋養細胞MMP2 mRNA和蛋白的表達，表明微電場可通過作用于滋養細胞使其活性增加，從而促進滋養細胞的浸潤，改善由于浸潤不足導致的各種產科疾病。本研究結果提示，微電場可能是調控滋養細胞MMP2表達的又一重要因素，為改善由于浸潤不足所致的妊娠相關疾病提供了又一重要的理論依據和實踐方法。

生理情況下，滋養細胞MMPs的表達依賴于其抑制因子TIMPs的調控。組織抑制因子是一類具有多種生理功能的多肽，能以非共價鍵的形式與MMPs結合，從而對MMPs的活性產生特異性抑制。TIMPs在減慢細胞外基質降解、維持細胞外基質成分的更新與自穩過程中發揮重要作用。其中，TIMP1(28.5×103)廣泛存在于組織和體液中，能被多種細胞因子誘導產生，是MMP9的特異抑制因子[2-3]；TIMP2(21.0×103)常隨MMP2的表達而表達，受細胞因子的誘導作用較小，是MMP2的特異抑制因子[2-3]。本研究未發現微電場對滋養細胞TIMP 2的表達有明顯的影響，提示微電場對滋養細胞侵襲功能相關蛋白酶的作用主要與上調MMP2表達有關。此外，本研究未發現150 mV/mm直流微電場對滋養細胞MMP9及其抑制因子TIMP1的表達水平有明顯影響。這可能是因為MMP2是胚胎植入較早期滋養細胞表達的蛋白酶，妊娠11周以后，MMP2的表達水平才開始降低[2-3]，而MMP9在胚胎植入較晚期胎盤滋養細胞的表達才增加。微電場顯著影響滋養細胞MMP2的表達水平，提示微電場可能對胚胎植入早期滋養細胞遷移/侵襲起到重要的影響作用，為胚胎植入早期應用微電場刺激促進滋養細胞功能，防治胎盤缺血缺氧性疾病的發生奠定了一定的理論基礎。

滋養細胞接受胞外信號的刺激發生相應的應答反應，產生特定的生物學效應，具有復雜的細胞內信息傳遞機制。迄今從化學分子如細胞外基質分子、生長因子、細胞因子和激素等作用于滋養細胞，促進其遷移作用的研究結果表明，有多條信號通路參與滋養細胞的遷移功能的調控，包括FAK、MAPK、PI3K/AKT和STAT3等信號通路的活化[14]。本研究結果發現，微電場刺激滋養細胞能使胞內FAK及其下游Paxillin分子發生磷酸化而激活胞內相關的信號通路[6，15]，提示微電場刺激可能是通過活化與細胞遷移/侵襲功能相關的蛋白激酶FAK及其下游Paxillin分子從而上調MMP2的表達水平，活化胞內相關信號傳導通路，最終促進滋養細胞的遷移/侵襲功能。關于其詳細的調控機制仍需要進一步深入研究。

本研究獲得的成果對微電場作為一種可能的生理性信號促進滋養細胞的功能及其機制的探索以及將微電場用于促進胎盤功能，防治胎盤缺血缺氧性疾病的發生奠定了理論基礎，具有實際意義和應用前景。

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Effect of small direct-current electrical stimulation on migration and invasion related MMPs/TIMPs expression of trophoblast cells*

ZhangJuan1,LiMingyong1,HeYuan1,BaiHuai2,FanPing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalScience/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China;2.WestChinaSecondHospitalofSichuanUniversity/WesternWomen′sandChildren′sMedicalResearchInstitute,Chengdu,Sichuan610041,China)

ObjectiveTo investigate the effect of small direct-current electrical stimulation on migration and invasion related MMPs/TIMPs expression of trophoblast cells.MethodsThe trophoblast cells were exposed to the direct current electrical field at 150 mV/mm for 5 and 10 hours.Cell images were recorded with continuous photographing and analyzed by image analyzer.The expression levels of MMP2,MMP9,TIMP1 and TIMP2 were measured using quantitative RT-PCR and Western blot.ResultsIn non-electrical field culture trophoblast cells migrated slowly with random directions.Trophoblast cells cultured in media containing 10% calf serum with the application of 150 mV/mm direct current electrical stimulation,showed marked cathodal migration (P<0.01),the cell body stretched,perpendicular to the direction of the electric field.Compared with the non-electrical field stimulation controls,trophoblasts under the electrical field stimulation had the increased MMP2 mRNA and protein expression (P<0.05)，while MMP9,TIMP1 and TIMP2 had no obvious changes of mRNA or protein expressions.ConclusionPhysiological direct-current electrical fields might induce directed migration and perpendicular orientation of trophoblast cells.The enhanced MMP2 expression may play an important role in the migration and invasive activity of trophoblast cells in small electrical field.

trophoblasts cells;matrix metalloproteinases;tissue inhibitor of metalloproteinase;migration;invasion;electrical field

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.002

國家自然科學基金資助項目(30872774/H0418)；四川省衛生和計劃生育委員會基金資助項目(140071)。作者簡介：張娟(1982-)，主管技師，博士，主要從事妊娠相關疾病機制研究及臨床血液和生化檢驗工作。

R714.21

A

1671-8348(2016)07-0869-04

2015-09-08

2015-11-28)