熱處理光滑念珠菌對大鼠氣道上皮細胞Dectin-1、IL-6和TNF-α表達的影響*

張　雪，駱雪萍△，白　劍，王玉春，吳呈霖，趙　瑩

(1.桂林醫學院第二附屬醫院重癥醫學科，廣西桂林 541100；2.桂林醫學院，廣西桂林 541004；3.桂林醫學院第二附屬醫院檢驗科，廣西桂林 541100)

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·論著·

熱處理光滑念珠菌對大鼠氣道上皮細胞Dectin-1、IL-6和TNF-α表達的影響*

張雪1，駱雪萍1△，白劍2，王玉春3，吳呈霖1，趙瑩1

(1.桂林醫學院第二附屬醫院重癥醫學科，廣西桂林 541100；2.桂林醫學院，廣西桂林 541004；3.桂林醫學院第二附屬醫院檢驗科，廣西桂林 541100)

目的探討大鼠氣道上皮(RTE)細胞與熱處理光滑念珠菌孵育后Dectin-1、IL-6和TNF-α的表達及意義。方法以體外培養的RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育后分別于2、4、6 h觀察RTE細胞形態變化，以未與光滑念珠菌孵育的RTE細胞為對照組。用Western blot法檢測Dectin-1蛋白的表達；實時熒光定量PCR檢測IL-6和TNF-α mRNA的表達；ELISA法檢測上清液IL-6和TNF-α的分泌。結果隨著孵育時間的延長，RTE細胞破壞逐漸加重及Dectin-1、IL-6和TNF-α 的表達呈進行性增高。孵育2 h組與對照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，Dectin-1、IL-6和TNF-α 的表達差異有統計學意義(P<0.05)。結論RTE細胞具有天然免疫功能，其Dectin-1參與了對熱處理光滑念珠菌的識別，并激活IL-6和TNF-α的分泌，介導炎性反應。IL-6起負性調節作用。

熱處理光滑念珠菌；Dectin-1受體；大鼠氣道上皮細胞；腫瘤壞死因子α；白細胞介素6

近年由于廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑等的應用，使侵襲性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)的發病率增高，尤以重癥監護病房(ICU)最多見[1]。ICU患者多以侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection,IPFI)最為常見，IPFI已成為導致重癥患者死亡的主要原因之一。以往IFI的病原菌以白色念珠菌為主，近年非白色念珠菌所占比例明顯增加，其中光滑念珠菌和熱帶念珠菌占較大比例，有報道光滑念珠菌幾乎成為ICU非白色念珠菌中首位致病菌[2]。本研究通過大鼠氣道上皮(rat tracheal epithelia，RTE)細胞與熱處理光滑念珠菌孵育，探討熱處理光滑念珠菌對RTE 細胞Dectin-1受體、IL-6和TNF-α表達的影響。

1　材料與方法

1.1細胞培養RTE細胞購于北京協和細胞資源中心。培養于DMEM F12 1∶1混合培養基中(含10%胎牛血清及青鏈霉素)。常規培養、傳代，培養條件37 ℃、5%CO2細胞培養箱生長。

1.2菌種標準光滑念珠菌，編號9627，購自上海酶聯生物科技有限公司。將光滑念珠菌標準菌株接種于沙堡培養基，在37 ℃真菌培養箱培養48 h后，挑取菌落于高溫高壓滅菌PBS沖洗2次，配制成懸液，血球計數板倒置顯微鏡下計數，1 200 rpm 4 ℃離心棄上清，用無菌PBS緩沖液重懸，于56 ℃環境下進行熱處理30 min[3]，4 ℃儲存備用。

1.3RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育實驗

1.3.1孵育前細胞準備棄培養基，PBS沖洗，棄PBS，胰酶消化，終止消化，離心，血球計數板倒置顯微鏡下計數，調整細胞密度至5×105/mL，每孔各取1 mL細胞懸液加入6孔板，放入培養箱培養24 h。

1.3.2孵育實驗及分組稀釋光滑念珠菌液，計數，調整濃度為5×106/mL，每孔加100 μL菌液，孵育復數(multiplicity of infection,MOI)為1[4]。第1次向六孔板任意一孔加入菌液后，每隔2 h，分別再向其他六孔板任意一孔加入菌液，總共加菌液3次，分別標記孵育6 h組、孵育4 h組和孵育2 h組。再從剩余孔中隨機選取一孔，此標記為對照組。

1.4Western blot檢測Dectin-1蛋白終止各組孵育，將細胞收集加入蛋白裂解液，離心提取上清液。應用BCA定量法計算蛋白濃度。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將凝膠中蛋白轉移至PVDF膜上。TBS-T洗膜，封閉后，與一抗孵育，次日與二抗孵育。TBS-T洗膜后加入化學發光試劑，X線膠片曝光。應用Image J軟件分析并計算各組條帶灰度值。

1.5實時熒光定量PCR檢測IL-6和TNF-α終止各組孵育，收集細胞加入1 mL Trizol，按照說明書提取RNA。以2 μg總RNA為模板，按照說明書配制逆轉錄反應體系，合成cDNA第一鏈。IL-6引物序列：上游5′-ACA GCG ATG ATG CAC TGT CA-3′，下游5′-ACG GAA CTC CAG AAG ACC AG-3′；TNF-α引物序列：上游5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT-3′，下游5′-AGA TGA TCT GAG TGT GAG GGT C-3′；β-acting引物序列：上游5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，下游5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。實時熒光定量PCR反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40循環。基因相對表達量以2-△△Ct表示。

1.6上清液ELISA檢測IL-6和TNF-α因子終止各組孵育，分別取100 μL共培養細胞上清液，按ELISA 檢測試劑盒說明進行，繪制曲線，得出各組IL-6和TNF-α的表達濃度。

2　結　　果

2.14組RTE細胞光鏡觀察RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育光鏡下見對照組RTE細胞形態清晰、完整；孵育2、4、6 h組可見RTE細胞形態不完整，邊緣模糊。孵育2 h 組與對照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，RTE細胞碎片及光滑念珠菌孢子逐漸增多。見圖1。

2.24組Dectin-1受體蛋白的表達及比較Western blot印跡見圖2。4組Dectin-1的表達見表1。孵育2 h組與對照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，Dectin-1蛋白的表達差異有統計學意義(P<0.05)。

A:對照組；B:孵育2 h組；C:孵育4 h組；D:孵育6 h組。

圖14組RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育光鏡觀察(×20)

1：對照組；2：孵育2 h組；3：孵育4 h組；4：孵育6 h組。

圖2　　4組RTE細胞受體Dectin-1蛋白表達 表1　　4組Dectin-1蛋白的表達

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

2.34組IL-6和TNF-α mRNA實時熒光定量PCR結果及比較實時熒光定量PCR(圖3～6)示待測基因的熒光信號真實可信。 RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育后，4組IL-6和TNF-α mRNA的表達見圖7、8，表2、3。孵育2 h組與對照組比較、孵育4 h組與孵育2 h組比較、孵育6 h組與孵育4 h組比較，IL-6和TNF-α mRNA的表達均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3　　IL-6 mRNA擴增產物溶解曲線分析

圖4　　IL-6 mRNA實時熒光定量PCR擴增曲線

圖5　　TNF-α mRNA擴增產物溶解曲線分析

圖6　　TNF-α mRNA實時熒光定量PCR擴增曲線

圖7　4組RTE細胞中IL-6 mRNA 實時熒光定量PCR表達

圖8　4組RTE細胞中TNF-α mRNA實時 熒光定量PCR的表達表2　　4組IL-6 mRNA實時熒光定量PCR的表達

組別IL-6mRNA對照組1.0000±0.00000孵育2h組1.6310±0.10742a孵育4h組2.1915±0.16894b孵育6h組3.5987±0.13098c

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

表3　　4組TNF-α mRNA實時熒光定量PCR的表達

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較；c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

2.44組IL-6和TNF-α因子ELISA檢測的結果及比較ELISA顯示，孵育2 h組與對照組比較、孵育4 h組與2 h組比較，孵育6 h組與4 h組比較，IL-6和TNF-α的表達均顯著升高(P<0.05)。見表4、5。

表4　　4組上清液IL-6因子的表達

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

表5　　4組上清液TNF-α因子的表達

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與孵育2 h組比較;c:P<0.05，與孵育4 h組比較。

3　討　　論

當真菌進入呼吸道，首先接觸氣道上皮細胞。一般情況下當纖毛清除系統有效運行時真菌能被迅速清除。當宿主免疫力低下、免疫狀態抑制或吸入真菌數量遠遠超過氣道防御屏障清除能力時，真菌即可侵入機體導致真菌感染。此時，氣道上皮細胞的早期識別能力和免疫趨化等天然免疫功能顯得尤為重要。以往氣道上皮細胞僅被認為起著機械物理屏障作用，但隨著深入研究發現氣道上皮細胞還是呼吸道應對病原微生物感染產生免疫應答的前哨細胞(sentinel cell)。更重要的是氣道上皮細胞可通過病原識別受體(pathogen recognition receptor，PRR)識別真菌并構成強大的免疫屏障，從而成為抵抗真菌等病原微生物入侵機體的第一道防線[5]。

真菌侵入機體后，首先通過PRR對真菌表面病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)進行識別啟動天然免疫。PRR是啟動整個天然免疫應答的樞紐[6]。真菌細胞壁任何成分都可能是潛在的 PAMP，位于細胞壁最內層的β-葡聚糖是重要的PAMP。由于β-葡聚糖被甘露聚糖-甘露糖蛋白層覆蓋，從而阻止PRR對其的直接識別。當細胞壁破壞時β-葡聚糖被釋放，宿主受體對暴露的β-葡聚糖碎片識別啟動天然免疫。本研究發現隨著RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育時間的延長，RTE細胞形態完整性逐漸破壞，細胞溶解、被吞噬現象越來越嚴重，細胞碎片逐漸增多，菌群數量不斷增多，甚至幾乎覆蓋全部RTE細胞。以上現象均提示熱處理的光滑念珠菌仍具有很強致病性，通過熱處理[3]可使光滑念珠菌細胞壁內層的β-葡聚糖暴露，而暴露了的β-葡聚糖是光滑念珠菌致病的重要成分，這與本研究團隊在大鼠整體實驗中的研究結果一致[7]。

C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLR)是天然免疫中重要的PRR之一，CLR能誘導細胞內信號傳導[8]。CLR家族中的樹突狀細胞相關性Dectin-1與真菌感染密切相關，是識別真菌β-葡聚糖重要的PRR[9]。Dectin-1由胞外糖識別結構域(carbohydrate recognition domains，CRDs)、跨膜區域和細胞質免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)結構域構成[10]。正常情況下Dectin-1呈低表達。本實驗研究結果顯示隨著RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育時間延長，Dectin-1的表達呈進行性升高，具有時間依賴性。由此可見，RTE細胞不僅具有氣道的屏障功能，同時還有抗真菌的天然免疫功能，其Dectin-1是識別光滑念珠菌β-葡聚糖的重要PRR。

Dectin-1識別β-葡聚糖后還可誘發一系列的下游細胞因子的表達及炎性反應。Li等[11]研究發現用白色念珠菌β-葡聚糖體外刺激人急性單核白血病細胞，能引起固有免疫反應并使下游因子TNF-α、IL-6和IL-8表達增加。Gow等[3]研究也發現用人外周血單核細胞、鼠腹膜巨噬細胞分別與白色念珠菌孵育，熱處理組白念珠菌釋放更高的TNF-α、IL-6、IL-10和IFN-γ等因子。本實驗結果同樣顯示RTE細胞與熱處理光滑念珠菌孵育后IL-6 和TNF-α mRNA的表達、IL-6 和TNF-α的分泌均隨孵育時間延長而顯著上調，與Li等[11]和Gow等[3]用白色念珠菌β-葡聚糖與細胞孵育TNF-α和IL-6等因子表達水平明顯升高的研究結果一致。Leal等[12]研究發現敲除Dectin-1基因的小鼠真菌感染時IL-1β等細胞因子生成受阻，粒細胞浸潤減少和菌絲清除能力下降，尤其是在高表達β-葡聚糖真菌感染時上述表現更明顯。然而，目前對于IL-6在真菌感染中發揮的作用尚未完全明確，甚至有爭議。傳統認為在真菌感染期間，IL-6的分泌對于機體是起保護防御作用的。但近期研究[13]顯示，在真菌性血流感染中IL-6和TNF-α的分泌量與疾病的嚴重程度有關。本實驗研究發現隨著IL-6和TNF-α表達的進行性增高，RTE細胞被侵蝕、溶解更加顯著，提示IL-6起了負性調節的作用，與真菌性血流感染的研究結果相似。由此可見，在真菌感染過程中，過強的免疫反應及過度的免疫應答會引起大量的炎性介質釋放產生局部免疫損傷，這些對宿主自身是不利的。

綜上所述，具有氣道重要屏障功能的RTE細胞同樣具有抗真菌的天然免疫功能。RTE細胞的Dectin-1參與了對熱處理光滑念珠菌的識別，經熱處理的光滑念珠菌仍具有較強的致病性，其暴露了的β-葡聚糖可直接作為PAMP被RTE細胞Dectin-1識別，并誘導下游細胞因子及炎性因子IL-6和TNF-α的表達。IL-6作為免疫反應中的重要的細胞因子在RTE細胞光滑念珠菌感染中起到了負性調節作用。因此，充分認識Dectin-1及IL-6可能在免疫學方面為臨床抗真菌治療提供一個新的靶點。

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Effects of heat-treated candida glabrata on the expression of Dectin-1,the production of IL-6 and TNF-α in rat tracheal epithelial cells*

ZhangXue1,LuoXueping1△,BaiJian2,WangYuchun3,WuChenglin1,ZhaoYing1

(1.DepartmentofICU,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541100,China;2.GuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541004,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541100,China)

ObjectiveTo explore the effects of co-cultured heat-treated candida glabrata with rat tracheal epithelial (RTE) cells on the expression of Dectin-1 and the production of IL-6 and TNF-α.MethodsRTE cells in vitro were co-cultured with heat-treated candida glabrata bacteria liquid for 2,4,6 h,while without co-cultured RTE cells were used as control group.We observed the morphological changes of RTE cells,detected the protein expressions of Dectin-1 by Western blot,used real-time PCR to detecte the mRNA expressions of IL-6 and TNF-α and measured protein expression of IL-6 and TNF-α by ELISA．ResultsWith the passing of time,the RTE cells were damaged extensively and the expression of Dectin-1,IL-6 and TNF-α became more and more significant.Obviously,there had significant difference in the expression of Dectin-1,IL-6 and TNF-α between the co-cultured 2 h group and the control group,the co-cultured 4 h group and the co-cultured 2 h group,the co-cultured 6 h group and the co-cultured 4 h group (P<0.05).ConclusionRTE cells have natural immune function.The Dectin-1 involves in the recognition of heat-treated Candida glabrata,activating secretion of IL-6 and TNF-α and mediating inflammatory reaction.IL-6 plays a negative regulation role.

heat-treated candida glabrata；Dectin-1 receptor；rat tracheal epithelial cells；tumor necrosis factor-α；interleukins-6

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.001

廣西醫療衛生重點科研課題(重2012007)；廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019209)。作者簡介：張雪(1987-)，住院醫師，碩士，主要從事重癥感染方面的研究?！?/p>

，E-mail:xueping-l@sohu.com。

R519

A

1671-8348(2016)07-0865-04

2015-09-14

2015-11-26)