MAPK信號通路對地塞米松抑制Jurkat細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的影響

周煥娟，何　莉

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MAPK信號通路對地塞米松抑制Jurkat細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的影響

周煥娟，何莉*

目的研究絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路對地塞米松(Dexamethasone，DEX)誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖的影響。方法觀察地塞米松、PD98059、SP600125、SB203580及地塞米松分別聯(lián)合PD98059、SP600125、SB203580對Jurkat細(xì)胞增殖及凋亡的抑制作用。以急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用WST-1法檢測細(xì)胞的增殖活力；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。結(jié)果地塞米松對Jurkat細(xì)胞24 h和48 h抑制細(xì)胞增殖50%的藥物濃度(IC50)分別為829、335 μM。100 μM以上地塞米松以時(shí)間、劑量依賴方式抑制Jurkat細(xì)胞增殖；地塞米松分別聯(lián)合PD98059、SP600125可增加對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，聯(lián)合SB203580對地塞米松抑制Jurkat細(xì)胞增殖無影響。10 μM地塞米松聯(lián)合20 μM PD98059可顯著增加地塞米松誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用，細(xì)胞凋亡率由8.5%升至28.4%。結(jié)論急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞為糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞。阻斷p38MAPK對地塞米松抑制Jurkat細(xì)胞增殖無明顯影響。阻斷ERK、JNK信號通路均可增強(qiáng)地塞米松對Jurkat細(xì)胞的殺傷作用，達(dá)到逆轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞對地塞米松的耐藥。急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞糖皮質(zhì)激素耐藥可能與ERK、JNK通路的活化有關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶信號通路；地塞米松；耐藥；凋亡；Jurkat細(xì)胞

0　引言

白血病是兒童惡性腫瘤中發(fā)病率最高的疾病，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)約占70%[1]，嚴(yán)重威脅兒童的健康成長。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)可引起淋巴細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期G1停滯，抑制其生長與增殖，始終貫穿著整個(gè)化療過程。國內(nèi)外重要指南均將強(qiáng)的松單藥治療7 d誘導(dǎo)試驗(yàn)的效應(yīng)作為評估兒童ALL預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[2]。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)，在小兒初治ALL中，10%～20%表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素原發(fā)耐藥，復(fù)發(fā)病例中70%為GC耐藥，嚴(yán)重威脅小兒ALL的療效及預(yù)后。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)是細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-jun N末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)及p38MAPK途徑，共同參與多種細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控等。目前認(rèn)為，細(xì)胞信號通路的異常激活或抑制與腫瘤耐藥有密切關(guān)系[3]。ERK信號通路在CD4+T細(xì)胞對地塞米松(Dexamethasone，DEX)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[4]，活化JNK、p38MAPK信號通路引起的糖皮質(zhì)激素受體功能受抑制與乳腺癌細(xì)胞糖皮質(zhì)激素耐藥相關(guān)[5]。目前，國內(nèi)關(guān)于MAPK信號通路的異常激活或抑制是否會(huì)影響人ALL耐藥細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素敏感性的相關(guān)研究較少。本研究采用糖皮質(zhì)激素耐藥Jurkat細(xì)胞，觀察ERK、JNK及p38MAPK途徑對DEX誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響，尋找逆轉(zhuǎn)ALL糖皮質(zhì)激素耐藥的方法。

1　材料與方法

1.1材料人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株，由中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自天津?yàn)旃荆籛ST-1購自碧云天公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；地塞米松磷酸鈉購自天津藥業(yè)焦作有限公司；PD98059、SP600125及SB203580購自碧云天公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將Jurkat細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。臺盼藍(lán)染色，拒染率>95%為對數(shù)生長期細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組單獨(dú)應(yīng)用DEX組、PD98059組、SP600125組、SB203580組和地塞米松分別聯(lián)合PD98059、SP600125、SB203580組，并設(shè)立陰性對照及空白對照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.3WST-1法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，將細(xì)胞懸液按每孔90 μL移至96孔板中，設(shè)立空白對照孔(無細(xì)胞孔)和陰性對照孔(未加藥孔)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔；各試驗(yàn)孔加入10 μL相應(yīng)梯度濃度藥物，分別處理相應(yīng)時(shí)間；每孔加入10 μL WST-1溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上以490 nm波長測定各孔吸光度(A)值。計(jì)算相應(yīng)各孔的細(xì)胞抑制率。抑制率(%)=(對照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值)/對照組平均A值×100%。抑制細(xì)胞增殖50%的藥物濃度(IC50)采用回歸法計(jì)算。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期細(xì)胞，予相應(yīng)濃度和時(shí)間的藥物處理后，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，設(shè)陰性對照和空白對照(未加Annexin V-FITC)。取1×106個(gè)重懸細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC并混勻。室溫避光孵育10 min；1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入10 μL碘化丙啶染色液并混勻，冰浴避光放置10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，X軸為Anexin V-FITC通道，Y軸為PI通道。左下象限(Anexin V-FITC-/PI-)代表活細(xì)胞，左上象限(Anexin V-FITC-/PI+)代表機(jī)械損傷細(xì)胞，右上象限(Anexin V-FITC+/PI+)代表壞死細(xì)胞，右下象限(Anexin V-FITC+/PI-)為凋亡細(xì)胞。

2　結(jié)果

2.1DEX、PD98059、SP600125、SB203580單用及聯(lián)合應(yīng)用對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

2.1.1DEX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用1、10、100、500 μM DEX分別處理Jurkat細(xì)胞24、48 h。當(dāng)DEX濃度達(dá)100 μM時(shí)，兩組Jurkat細(xì)胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示100 μM DEX作用48 h對Jurkat細(xì)胞有較明顯的增殖抑制作用，表明Jurkat細(xì)胞為糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞。并且100 μM以上DEX對Jurkat細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)呈時(shí)間、劑量依賴性。見表1。DEX作用于Jurkat細(xì)胞24、48 h的IC50分別為 829、335 μM。

2.1.2PD98059、SP600125、SB203580對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用20 μM PD98059、10 μM SP600125、20 μM SB203580分別處理Jurkat細(xì)胞48 h，對細(xì)胞的增殖抑制率分別為5.3%、6.5%和4.3%，與單用100 μM DEX組比較，三種阻滯劑對Jurkat細(xì)胞增殖無明顯影響。見圖1。

表1　DEX對Jurkat細(xì)胞的抑制增殖作用(%，n=3)

圖1　PD98059、SP600125、SB203580、DEX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用

2.1.3DEX分別聯(lián)合應(yīng)用PD98059、SP600125、SB203580對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用分別預(yù)先用20 μM PD98059、10 μM SP600125、20 μMSB203580處理Jurkat細(xì)胞1 h，然后加入1、10、100、500 μM DEX繼續(xù)作用48 h。聯(lián)合應(yīng)用PD98059組可顯著增加1、10、100 μM DEX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用。其抑制率分別由1.3%、5.6%、14.7%升至23.4%、24.7%、28.4% (t=22.19、12.68、3.80，P<0.05)。加用PD98059后，500 μM DEX 對Jurkat細(xì)胞增殖抑制率略升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.50，P>0.05)。聯(lián)合應(yīng)用SP600125組可增加100、500 μM DEX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用，使其抑制率分別由14.7%、30.4%升至26.9%、39.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.84、3.24，P<0.05)。加用SP600125后，1、10 μM DEX 對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制率無影響(t=2.02、1.95，P>0.05)。聯(lián)合應(yīng)用SB203580后，各濃度DEX對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用無明顯改變(t=0.69、0.87、2.53、1.25，P>0.05)。見圖2。

圖2　四組Jurkat細(xì)胞增殖抑制率比較(48 h)

2.2DEX、PD98059單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1DEX對Jurkat細(xì)胞凋亡的作用10 μM DEX作用Jurkat細(xì)胞48 h，細(xì)胞凋亡率為8.5%，提示Jurkat細(xì)胞對DEX誘導(dǎo)凋亡作用不敏感，為DEX耐藥細(xì)胞株。見圖3a。

2.2.2PD98059對Jurkat細(xì)胞凋亡的作用20 μM PD98059處理Jurkat細(xì)胞48 h，細(xì)胞凋亡率為7.4%，提示PD98059對Jurkat細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用。見圖3b。

2.2.3DEX聯(lián)合PD98059對Jurkat細(xì)胞凋亡的作用對照組、DEX組、PD98059組及DEX+PD98059組的凋亡率分別為5.8%±0.4%、8.5%±1.9%、7.4%±0.9%、28.4%±7.2%。結(jié)果表明，預(yù)先用20 μM PD98059處理Jurkat細(xì)胞1 h，然后加入 10 μM DEX繼續(xù)作用48 h，細(xì)胞凋亡率由8.5%升至28.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=4.62，P<0.05)。見圖3c。提示PD98059可顯著增強(qiáng)DEX的誘導(dǎo)凋亡作用，恢復(fù)Jurkat細(xì)胞對DEX的敏感性。見圖4。

圖3　三組Jurkat細(xì)胞凋亡情況比較(48 h)

圖4　DEX單用與聯(lián)合PD98059對Jurkat細(xì)胞的凋亡作用

3　討論

隨著診療水平的提高和化療方案的改進(jìn)，小兒ALL的治愈率可達(dá)80%[6]。盡管近年多種新型化療藥物進(jìn)入臨床，糖皮質(zhì)激素作為最早用于ALL化療的藥物，仍然貫穿于整個(gè)化療過程。對糖皮質(zhì)激素的敏感性已作為兒童ALL危險(xiǎn)度判定、治療方案選擇和預(yù)后判斷的一個(gè)重要的獨(dú)立指標(biāo)[7]。德國BFM研究表明，采用BFM90方案治療的ALL糖皮質(zhì)激素敏感患兒的5年無病生存率達(dá)80.7%，而糖皮質(zhì)激素耐藥者僅為31.8%[8]。由此可見，糖皮質(zhì)激素耐藥是小兒ALL治療失敗及復(fù)發(fā)的主要因素。本研究將DEX作用ALL Jurkat細(xì)胞24～48 h時(shí)，結(jié)果顯示，100 μM DEX作用48 h才能出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制作用。100 μM以上時(shí)，DEX以時(shí)間、劑量依賴方式抑制Jurkat細(xì)胞增殖，對DEX的耐藥情況與孟浦等[9]報(bào)道一致。而對DEX敏感的細(xì)胞，Rambal等[10]報(bào)道，CCRF-CEM細(xì)胞在0.1 μM DEX處理48 h即可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。說明Jurkat細(xì)胞為糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞株。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，主要包括ERK通路、JNK通路和p38MAPK通路，共同參與多種細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等。最近研究表明，這些通路的異常激活或阻斷與腫瘤耐藥產(chǎn)生有關(guān)[6]。Suzuki等[11]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用ERK阻滯劑，可增加急性單核白血病THP-1及MV4-11細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性，說明抑制ERK信號通路，可以逆轉(zhuǎn)急性單核白血病細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥性。利用JNK阻滯劑SP600125處理卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞株可增加對順鉑的耐藥性，推測JNK信號通路的激活程度與卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性呈正相關(guān)[12]。阻斷p38MAPK信號通路可增加小鼠白血病細(xì)胞L1210對長春新堿的敏感性，逆轉(zhuǎn)長春新堿耐藥[13]。

本研究以糖皮質(zhì)激素耐藥型Jurkat細(xì)胞株為研究對象，利用信號通路特異性阻滯劑聯(lián)合DEX作用，探討ERK、JNK及p38MAPK信號通路在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡過程中的作用。結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用ERK通路阻滯劑PD98059，可增強(qiáng)DEX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用，其中以1、10 μM DEX對Jurkat細(xì)胞增殖抑制率的增加最顯著，分別由1.3%、5.6%增加至22.4%、24.7%。流式細(xì)胞結(jié)果證實(shí)，預(yù)先用PD98059處理1 h后再加10 μM DEX繼續(xù)作用48 h，可顯著增加DEX對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用，細(xì)胞凋亡率由8.5%升至28.4%。以同樣劑量的PD98059單獨(dú)處理Jurkat細(xì)胞，對細(xì)胞無影響。Rambal等[10]研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞白血病Molt-4細(xì)胞聯(lián)合1 μM DEX和5 μM PD98059共同作用72 h，細(xì)胞凋亡率約為60%，比單用DEX升高6倍。由此可見，在多種糖皮質(zhì)激素耐藥型T-ALL細(xì)胞中，通過阻斷ERK信號通路可恢復(fù)其對糖皮質(zhì)激素的敏感性，使較低濃度DEX也可發(fā)揮明顯的細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。因此，ERK信號通路的異常激活可能參與ALL糖皮質(zhì)激素耐藥的產(chǎn)生，阻斷該通路可作為逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素耐藥治療的新靶點(diǎn)。

JNK信號通路對于不同的細(xì)胞類型及刺激的產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及存活過程發(fā)揮不同作用。Qu等[14]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合As2O3和JNK特異性阻滯劑SP600125處理急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞，可阻斷As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞生長阻滯和細(xì)胞凋亡作用。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合SP600125與DEX處理Jurkat細(xì)胞48 h，可見加用SP600125可增加100、500 μM DEX對Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用，使其抑制率分別由14.7%、30.4%增加至26.9%、39.1%。而低濃度DEX (1、10 μM)對Jurkat細(xì)胞無增殖抑制作用。提示阻斷JNK信號通路后，仍需較高濃度DEX才能出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒作用。由此可見，阻斷JNK信號通路可增加ALL Jurkat細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素的敏感性，ALL細(xì)胞糖皮質(zhì)激素耐藥的產(chǎn)生可能與JNK的異常激活有關(guān)，阻斷該通路是一種潛在的逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素耐藥的治療方法。

p38MAPK信號通路是細(xì)胞內(nèi)抑制增殖途徑。Miller等[15]研究表明，DEX作用于糖皮質(zhì)激素敏感型CEM細(xì)胞24 h后，可觀察到p38MAPK磷酸化水平升高，提示糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)p38MAPK活化，DEX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程需要p38MAPK參與，阻斷p38MAPK信號通路可顯著減弱糖皮質(zhì)激素對淋巴細(xì)胞的殺傷作用[16-19]。本研究結(jié)果表明，聯(lián)合DEX與p38MAPK通路阻滯劑SB203580 作用48 h，對DEX引起的Jurkat細(xì)胞增殖抑制效果無明顯影響。其原因考慮為Jurkat細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素耐藥，細(xì)胞內(nèi)p38MAPK處于低表達(dá)水平，被阻斷后對下游分子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用不明顯。推斷p38MAPK信號通路受抑可能成為糖皮質(zhì)激素耐藥產(chǎn)生的機(jī)制。

總之，ALL Jurkat細(xì)胞為糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞。阻斷p38MAPK對地塞米松抑制Jurkat增殖無明顯影響；阻斷ERK、JNK信號通路均可增強(qiáng)地塞米松對Jurkat細(xì)胞的殺傷作用，逆轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞對地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡耐藥；阻斷ERK信號通路可顯著增加低濃度DEX對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。由此推測，急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞糖皮質(zhì)激素耐藥與ERK、JNK信號通路的異常激活和p38MAPK通路阻斷有關(guān)。特異性阻斷ERK、JNK信號通路或激活p38MAPK信號通路可能成為逆轉(zhuǎn)ALL糖皮質(zhì)激素耐藥的新的治療方法。

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Effect of MAPK signal pathway on proliferation and apoptosis inhibited and induced by dexamethasone in Jurkat cells

ZHOU Huan-juan,HE Li*

(Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

ObjectiveTo study the effect of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal pathway on the inhibition of proliferation and apoptosis induced by dexamethasone in glucocorticoid-resistance Jurkat cell line.MethodsThe inhibition of proliferation and apoptosis of Jurkat cell,after being treated respectively with dexamethasone,PD98059,SP600125,SB203580 and dexamethasone combined with PD98059,SP600125 and SB203580,was observed.The proliferation and apoptosis was detected by WST-1 assay and flow cytometry respectively using Jurkat cell as the subjects.ResultsThe 24 h and 48 h IC50of dexamethasone to Jurkat cell was 829 μM and 335 μM.Dexamethasone inhibited the proliferation of Jurkat cell in a dose-/time- dependent manner when the concentration was more than 100 μM.Dexamethasone combined with PD98059 and SP600125 could enhance the inhibition effect of dexamethasone,but no significant inhibition effect was observed when it was combined with SB203580.Dexamethasone 10 μM combined with PD98059 20 μM could significantly promote the apoptosis induced by dexamethasone in Jurkat cell.The apoptosis rate rose from 8.5% to 28.4%.ConclusionAcute lymphoblastic leukemia Jurkat cell is resistant to glucocorticoid.Inhibiting p38MAPK has no obvious influence on the proliferation of Jurkat cell,while inhibiting ERK or JNK signal pathway can enhance the effect of dexamethasone on Jurkat cell,thus reversing the resistance of Jurkat to dexamethasone.The activation of ERK and JNK signal pathway plays an important role in glucocorticoid resistance of acute lymphoblastic leukemia.

Mitogen-activated protein kinase signal pathway;Dexamethasone;Resistance;Apoptosis;Jurkat cell

2016-04-27

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，沈陽 110001

遼寧省高等學(xué)校科研項(xiàng)目計(jì)劃(2008821)；2.遼寧省博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(20081050)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608004