DEHP、MEHP對小鼠胚胎干細胞細胞毒性的研究

李玉秋，段志文，裴秀叢，張玉敏，馬明月

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·論著·

DEHP、MEHP對小鼠胚胎干細胞細胞毒性的研究

李玉秋，段志文，裴秀叢，張玉敏，馬明月*

目的分析不同濃度的鄰苯二甲酸二乙基己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP] 及其活性代謝產物鄰苯二甲酸單乙基己基酯[mono (2-ethylhexyl) phthalate，MEHP)對小鼠胚胎干細胞細胞毒性、增殖的影響。方法用含有不同濃度DEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)、MEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)的培養液，對胚胎干細胞進行培養，用CCK-8法檢測細胞活性。結果染毒96 h后，高劑量(1 000 μmol/L) DEHP、MEHP均對胚胎干細胞的增殖有抑制作用(P<0.05)，且染毒劑量與細胞抑制率之間存在明顯的正相關性，相關系數分別為0.51、0.62 (P<0.05)。結論在一定濃度范圍內，DEHP及MEHP均對小鼠ESC具有細胞毒性，且有濃度依賴性。

DEHP；MEHP；小鼠胚胎干細胞；細胞毒性

0　引言

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]作為可塑劑，全球年產量達300～400萬噸[1]，廣泛應用于包裝材料、醫療用品、兒童玩具以及化妝品等制造行業[2]。DEHP僅依靠分子間的作用力，而非化學鍵實現與塑料主體基質的結合，因此可以不斷地從塑料制品中游離出來[3]，污染空氣、土壤、水源甚至食物。可經消化道、肺和皮膚吸收進入人體，以消化道吸收為主。另外，DEHP還可以通過輸液、透析等途徑直接進入血液[4]；甚至能通過胎盤屏障直接作用于胎兒，影響胎兒發育[5]。DEHP在進入機體后，經酶作用水解為活性代謝產物鄰苯二甲酸單乙基己基酯[Mono(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP]而被吸收，威脅人類的健康。隨著干細胞研究的發展，具有無限增殖、自我更新特性[6]的胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)，因其能靈敏、準確地評價毒物的毒性作用，而被廣泛應用于各種研究中。本研究使用不同濃度的DEHP及其活性代謝產物MEHP培養小鼠ESC，研究DEHP和MEHP對小鼠ESC的細胞毒性。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞小鼠ESC M1細胞系、小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryo fibroblasts，MEF) (C57/BL6，P3 輻照后)均購自中國上海斯丹賽生物技術有限公司。

1.1.2儀器和試劑SeriesII 3 110 CO2培養箱(美國Thermo公司)、超凈工作臺(中國北京東聯哈爾儀器制造有限公司)、倒置顯微鏡(中國北京欣惠澤奧科技有限公司)、ST 16離心機(德國Thermo公司)、酶標儀(美國Molecular Device公司)。DEHP(純度：99%，美國Sigma公司)；MEHP(純度：98%，美國Pharmachem公司)；小鼠ES細胞完全培養基、小鼠ES細胞分化培養基、AP染色液試劑盒(中國上海斯丹賽生物技術有限公司)；基礎培養基(DMEM/F12，美國HyClone)；胎牛血清(美國Biochrom)；青霉素-鏈霉素(美國Biological Industries公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；明膠(美國Sigma公司)；CCK-8 細胞活性試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠ESC的復蘇與培養T25培養瓶中加入1 mL明膠，使其平鋪培養瓶底，37 ℃、5%CO2溫箱中培養20 min以上，吸棄明膠，加4 mL含10%FBS的MEF培養基備用。從液氮中取出MEF細胞凍存管，37 ℃水浴鍋中快速解凍并不斷搖動。凍存管消毒后，將全部的細胞懸液移入之前備好的培養瓶中。放于37 ℃、5%CO2溫箱培養2 d，制成滋養層細胞。滋養層細胞長成熟后，將培養液吸棄，用1 mL小鼠ESC完全培養液清洗1遍，快速復蘇小鼠ESC并種入(方法如前)，補加小鼠ESC完全培養液至4 mL，在37 ℃、5%CO2溫箱培養。每天換液，培養5～7 d，ESC可進行傳代。

1.2.2小鼠ESC的鑒定顯微鏡觀察ESC的生長及形態特征。

堿性磷酸酶(AP)染色：①吸出細胞培養液，用PBS潤洗2～3次；②用4%多聚甲醛固定1～2 min，吸出固定液，用PBS洗2次；③吸出PBS，用TBST潤洗2次；④準備堿性磷酸酶試劑：溶液A(白瓶蓋)∶溶液B(綠瓶蓋)∶溶液C=50 μL∶12.5 μL∶437.5 μL；⑤吸棄TBST溶液；⑥加入足量的染色試劑使染色液能足夠覆蓋孔底，室溫避光放置15～20 min；⑦吸出染色液，用PBS緩沖液潤洗1次，最后保存于PBS溶液中，顯微鏡下觀察染色結果(未分化細胞染色為藍/紫色，分化的細胞染色為無色)。

1.2.3DEHP、MEHP的配制將DEHP、MEHP分別溶解于DMSO中，用小鼠ESC分化培養基稀釋得到濃度為10 000 μmol/L的母液(DMSO含量為1%)。之后分別稀釋出含DEHP、MEHP濃度為1 000、100、10、1、0.1 μmol/L的培養液。同時用小鼠ESC分化培養基配置含1% DMSO的培養液作為對照。

1.2.4小鼠ESC細胞活性檢測用0.25%胰酶將處于對數生長期的小鼠ESC消化，收集細胞。用小鼠ESC分化培養基將細胞稀釋為10×104個/mL，以100 μL/孔種于96孔板中。溫箱培養24 h貼壁后，將含不同濃度DEHP、MEHP及1% DMSO的培養液以10 μL/孔加入到96孔板中，每個劑量設3個復孔。溫箱培養96 h后，加入CCK8 (10 μL/孔)，溫箱繼續培養3 h，于酶標儀450 nm波長處測吸光度OD值。第3天換液。

2　結果

2.1小鼠ESC的鑒定在倒置顯微鏡觀察下，小鼠ESC在MEF為支持的滋養層細胞上呈克隆生長，邊緣清晰，細胞聚集緊密，如圖1。將處于對數生長期的ESC，用堿性磷酸酶(AP)染色試劑盒染色，未分化的ESC呈藍紫色細胞團，而分化的細胞未著色，見圖2。

圖1　小鼠ESC、MEF細胞生長狀況

圖2　小鼠ESC的堿性磷酸酶染色

2.2DEHP、MEHP對小鼠ESC增殖的影響與對照組相比，DEHP、MEHP對小鼠ESC染毒96 h后，高劑量(1 000 μmol/L)組的吸光度值均顯著下降(P<0.05)，見表1。細胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。高劑量(1 000 μmol/L)的DEHP、MEHP對小鼠ESC抑制作用明顯增強(P<0.05)，見表1。

表1　DEHP、MEHP對小鼠ESC細胞增殖及細胞抑制率的影響(n=3)

注：*與對照組比較，P<0.05

2.3不同濃度DEHP、MEHP對小鼠ESC細胞活性抑制作用的相關性DEHP、MEHP的染毒劑量與小鼠ESC受到的抑制作用呈顯著的正相關性，相關系數分別為0.51、0.62 (P<0.05)，見表2。即隨著染毒劑量的增加，DEHP、MEHP對小鼠ESC活性的抑制作用增強，存在明顯的劑量依存關系。

表2　不同濃度DEHP、MEHP與小鼠ESC細胞抑制率的相關性

3　討論

ESC是指受精卵分裂發育成囊胚時，從內細胞團(Inner cell mass)[7]分離出的細胞，具有無限增殖、自我更新的特性，無論是在體內還是體外環境，都能被誘導分化為機體幾乎所有類型的細胞[6]。由于ESC具有全能性，且在體外連續傳代并保持未分化狀態，以及對受試物作用反應迅速、敏感性高、干擾因素少等優點[8]，是較好的體外替代試驗的生物材料。

自1981年Evans等[9]首次發現并分離小鼠ESC，1998年Thomson等[10]成功分離人類ESC，研究者們已經進行了大量的ESC研究，并且成功地建立了大鼠、小鼠、靈長類等多種動物的ESC細胞系[11]。這些細胞系中，小鼠、猴和人類的ESC細胞系可以在體外長期增殖并保持未分化狀態[12]，其中小鼠ESC體外分離培養更為簡單易行[13]，其培養方法也較為完善。Evans等[9]以STO細胞作為飼養層，Wobus等[14]以小鼠原代胚胎成纖維細胞(Primary embryonic fibroblast，pMEF)為分化抑制物，Nihcol等[15]在培養基中添加LIF作為分化抑制劑，由此可見，目前小鼠ESC培養技術已經基本成熟，并得到了廣泛應用。

DEHP是具有第2類生殖毒性的鄰苯二甲酸酯類物質，已被列入優先控制的污染物名單中[16]。其急性毒性較弱，但動物實驗發現，DEHP及其代謝產物MEHP對發育中及成年動物的心、肝、肺、腎及生殖系統等多種組織系統均能產生廣泛的慢性毒性作用，甚至具有致畸性、致突變性和致癌性[17]。Shi等[18]報道，高劑量(1 000 μmol/L)的MEHP能抑制人ESC細胞增殖，具有明顯的細胞毒性。本研究發現，高劑量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的細胞活性。Lim等[19]報道，1 000 μmol/L MEHP可使小鼠胚胎干細胞的細胞活性明顯降低，與本研究結果一致。筆者研究發現，DEHP、MEHP的染毒劑量與細胞抑制率存在劑量依賴關系，與Janer等[20]關于MEHP對胚胎生長有濃度依賴性的研究結果一致。

本研究發現，高劑量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的活性，具有細胞毒性，且存在劑量依賴關系，但其作用機制還需進一步研究。

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Effect of DEHP and MEHP on the cytotoxicity of embryonic stem cell of mouse

LI Yu-qiu,DUAN Zhi-wen,PEI Xiu-cong,ZHANG Yu-min,MA Ming-yue*

(Department of Toxicology,School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

ObjectiveTo investigate the effect of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) on the cytotoxicity of mouse embryonic stem cells (mESC).MethodsmESC was cultured in the culture media of DEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L) and MEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L).Cell viability was evaluated by CCK8.ResultsThe inhibition rate of 1 000 μmol/L of DEHP and MEHP on mESC after 96 h increased significantly (P<0.05).In addition,the inhibition rate was correlated with the concentration of DEHP and MEHP positively,the correlation coefficient being 0.51 and 0.62 respectively (P<0.05).ConclusionDEHP and MEHP both have dose-dependent cytotoxicity on mESC.

DEHP;MEHP;mESC;Cytotoxicity

2016-03-14

沈陽醫學院公共衛生學院毒理學教研室，沈陽 110034

沈陽市科技局項目(F14-158-9-22)；遼寧省教育廳一般項目(L2014414)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608001