心肌細胞電位傳感器在海洋生物毒素檢測中的研究*

方佳如，王　琴，黎洪波，蘇凱麒，潘宇祥，王　平

（浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027）

心肌細胞電位傳感器在海洋生物毒素檢測中的研究*

方佳如，王琴，黎洪波，蘇凱麒，潘宇祥，王平*

（浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027）

目前海洋毒素對人類健康的威脅越加嚴重，尤其是麻痹性毒素。提出了一種基于細胞電位傳感器檢測貝類的生物毒性的新方法，采用心肌細胞與微電子加工技術的微陣列芯片（MEA）相結合，構建了新型的心肌細胞電位傳感器。通過心肌細胞與MEA芯片的緊密耦合，實現了實時監測心肌細胞電位的變化，輸出穩定和一致性好的胞外場電位信號。通過檢測海洋中危害較大的石房蛤麻痹性毒素（STX），分析細胞的信號特征參數，實驗結果表明，STX毒素對心肌細胞的電生理活動有明顯的抑制作用，對脈沖幅值和脈沖頻率有明顯的濃度依賴性抑制作用。常規標準的生物毒性檢測方法小鼠生物法的檢出限為40 g/100 g，而心肌細胞電位傳感器可檢測的下限為1.004 ng/mL，檢測范圍為25 nmol/L～1 600 nmol/L，通過對比表明該方法具有較好的檢出限且檢測方法相對簡單，易于規范化和標準化。通過進一步的完善，該方法在海洋毒素的快速檢測應用方面具有良好的發展前景。

細胞傳感器；微電極陣列；海洋毒素；心肌細胞電位檢測；胞外場電位信號

隨著現代化工農業的迅猛發展，近年來海洋污染的狀況越發嚴重。有害赤潮的頻繁發生和規模的不斷擴大，造成了巨大的經濟損失，并嚴重威脅著人類的身體健康［1］。所謂的海洋生物毒素，主要是由赤潮藻類產生的有毒生物活性物質，這些有毒微藻產生的毒素通過食物鏈在貝類或魚類體內富集，若人類誤食了這種有毒的貝類或魚類，則會引起食物中毒，甚至導致死亡［2-3］。根據毒素所引發的中毒癥狀的不同，海洋毒素可分為五類：麻痹性貝類毒素PSP（Paralytic Shellfish Poisoning）、腹瀉性貝類毒素DSP（Diarrhetic Shellfish Poisoning）、神經性貝類毒素NSP（Neurotoxic Shellfish Poisoning）、記憶缺失性貝類毒素ASP（Amnestic Shellfish Poisoning）和西加魚毒素CFP（Ciguatera Fish Poisoning），其中麻痹性貝類毒素是目前為止分布最廣、危害最大的一類海洋毒素［4-6］，而在PSP中，石房蛤毒素STX（Saxitoxin）占了總PSP的85%以上，是PSP中毒素最強的毒素［7］。PSP在貝類毒素中毒事件中屬最嚴重，因其劇烈毒性，經常造成消費者中毒死亡事件，攝入1 mg 的PSP就可致人死亡。該類毒素選擇性作用于電壓門控鈉離子通道，阻斷鈉離子內流，從而抑制動作電位的產生和電興奮傳播［8］。因此，對STX毒性進行檢測在人類健康和環境安全上是十分重要的。

目前，最常見的毒素檢測方法為小鼠生物法［9-10］，但因種種局限難以滿足海洋毒素監測的需要。常規的基于化學結構的高效液相色譜分析法（HPLC）［11-13］，由于所需設備昂貴且技術操作復雜，也難以完全取代小鼠生物法。近年來，一些基于功能活性的細胞檢測法陸續發展起來。

細胞電位傳感器［14-16］是一種常用的細胞傳感器，用于檢測具備電生理特性的細胞的電生理活動，因其無損、高靈敏、實時動態檢測等優勢而備受國內外研究者的關注［17］。麻痹性貝類毒素作用心肌細胞后，會引起細胞膜離子通道的功能發生紊亂，從而影響心肌細胞動作電位的發放和電興奮的傳播。而心肌細胞電位傳感器［18］可以檢測毒素引起的胞外場電位的變化，胞外場電位的變化程度可以反映毒素的毒性大小。心肌細胞電位傳感器在這類毒素的毒性研究中具有一定的應用價值。本文選擇穩態性強的電興奮心肌細胞作為敏感元件，并將心肌細胞電位傳感器應用于海洋毒素的檢測分析。

1　材料和方法

1.1材料

明膠（Gelatin，Sigma）、平衡鹽溶液 HBSS （Hanks’Balanced Salt Solution，Gibco）、胰蛋白酶（Trypsin，Gibco）、膠原蛋白酶（Collagenase Type II，Gibco）、高糖培養基DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Hyclone）、胎牛血清FBS（Fetal Bovine Serum，Gibco）；手術剪：大鑷子、眼科剪、眼科彎鑷；解剖板；5 mL玻璃瓶；10 mL、50 mL離心管；200目細胞篩；細胞培養瓶；60mm培養皿細胞；細胞計數板；EP管。

1.2心肌細胞電位傳感器理論基礎及芯片設計

細胞電位傳感器是一種用來無損、長時記錄細胞外場電位的細胞傳感器，敏感元件可采用具備電興奮特性細胞，如心肌細胞等。其中基于平面微電極陣列MEA（Microelectrode Array）［19-21］的細胞電位傳感器是目前最常用的胞外電位記錄手段。它可以實時檢測和記錄具備電興奮特性細胞的電生理信號。

微電極陣列芯片［22-24］是目前常用的細胞電傳感器芯片（如圖1（a）和1（b））。MEA芯片表面積為2 cm×2 cm，MEA呈6×6陣列排布，包括32個工作電極（記錄電極），單個圓形電極直徑大小為30 μm，電極間距為300 μm；4個參考電極，排布在芯片四角。MEA的基本結構包括三部分：絕緣基底，金屬層電極陣列，鈍化層。它的加工制作采用標準的微電子加工技術。

圖1　心肌細胞電位傳感器

心肌細胞培養在MEA芯片上（如圖1（d）），通過一層薄的電解液同芯片的電極相耦合。心肌細胞和MEA耦合在一起后，具有電興奮特性的心肌細胞會產生動作電位，可選擇性開啟和閉合的離子通道引起胞內外離子濃度的變化。胞外場電位便是由跨膜電壓變化和離子電流所引起。因此，通過檢測胞外的場電位變化，可有效地記錄心肌細胞的電生理信號（即胞外場電位信號）。

1.3心肌細胞傳感器優化實驗

選取清潔級健康24 h內新生SD大鼠（Sprague Dawley，購于浙江省醫學科學院），消毒，取心臟心尖部，置于預冷的高糖培養基中，去除心房和血管等組織。轉移心肌組織于HBSS溶液中，剪成約1mm3的小塊，棄上清，加入消化液（含0.07%胰蛋白酶和0.05%II型膠原酶），消化多次，直至心肌組織呈現疏松狀態。向心肌組織加入含10%FBS的培養基，輕輕吹打組織，收集單細胞懸浮液。離心重懸細胞、過濾，收集細胞懸液到培養瓶中進行差速貼壁2次。差速貼壁后，進行活細胞計數，心肌細胞按不同細胞密度（8×04/cm2～16×104/cm2）接種在預先用明膠進行表面修飾的MEA芯片上，培養1 d后開始檢測胞外場電位信號，每隔12 h檢測一次，每次檢測5 min，持續檢測1周。每個密度設置6個平行組。

1.4心肌細胞電位傳感器檢測海洋毒素的方法

1.4.1毒素樣品準備

標準毒素樣品的配制：海洋生物毒素的標準品（STX）購自加拿大公司，STX的標準品為粉劑。STX儲存液的配制：將STX粉劑溶于0.05 mmol/L的醋酸溶液中，配制成100 μmol/L的STX儲存液，再用過濾器將其進行過濾除菌-80℃保存。使用之前，用細胞培養液對毒素儲存液進行稀釋，配制成一系列濃度梯度的標準品工作液。

貝肉實際樣品PSP毒素的提取：①將采集的貝肉樣品用純水清洗干凈瀝干后，稱取20 g貝肉于50 ml燒杯中，加20 mL 0.18 mol/L的鹽酸溶液充分攪拌；②均質，調節pH在2.0～4.0范圍內；③將混合物加熱，并煮沸5 min；④冷卻至室溫，離心，取上清液備用；⑤上清液過濾后方可用于細胞分析。

STX加標毒素樣品的配制：用PSP毒素提取液對STX標準品的儲存液進行稀釋，配制成一系列濃度梯度的加標樣品工作液。

圖2　72 h后不同細胞密度下信號記錄與統計

1.4.2毒素檢測流程

原代心肌細胞按合適的細胞密度接種在預先用明膠鋪被的MEA芯片上，細胞培養48 h后，開始檢測胞外場電位信號，每隔12 h檢測一次，每次檢測2 min。一旦電位傳感器出現成熟的胞外場電位信號模式，即可進行毒素干預。毒素添加前，先進行細胞換液，換液2 h后，將MEA芯片連接到電位檢測儀上，開始檢測信號5 min，這段數據作為加度素前的信號基線。接著向實驗組的MEA細胞培養孔里加入10 μL毒素標準溶液（或毒素加標溶液）。毒素添加完畢立即開始檢測信號，記錄數據30 min。對照組加入等量的細胞培養液，實驗組和對照組分別設置6個平行組。

1.4.3數據分析

采用Matlab編寫的程序對心肌細胞電位傳感器的胞外場電位原始信號進行濾波處理、特征參數的提取及特征參數的歸一化。在數據分析中，主要提取了2個具有代表性的胞外場電位信號參數，脈沖幅值SA（Spike Amplitude）、脈沖頻率FR（Firing Rate），對麻痹性貝類毒素進行毒性評價。

2　結果與討論

2.1細胞密度對心肌細胞和芯片耦合的影響

合適的細胞密度是細胞和MEA芯片耦合緊密的一個重要因素，兩者耦合度越高，檢測到的信號就越強，越穩定。因此我們研究了不同細胞密度（8×104/cm2、10×104/cm2、12×104/cm2、14×104/cm2、16× 104/cm2）下構建的心肌細胞電位傳感器的信號特征。圖2（a）為第4天（大約培養72 h后）不同細胞密度下記錄到的胞外場電位信號。從圖中可以明顯觀察到，當細胞密度為12×104/cm2時，心肌細胞傳感器輸出的信號峰電位幅值最大，脈沖頻率最高。而當細胞密度過低或過高時，心肌細胞傳感器輸出的信號脈沖幅值大幅度下降，而且脈沖頻率也明顯減慢。

從原始信號中提取了兩個典型的特征參數脈沖幅值和脈沖頻率進行了統計分析。圖2（b）表示不同細胞密度下信號的脈沖幅值和脈沖頻率的統計結果。結果表明，當細胞密度為12×104/cm2時，心肌細胞傳感器輸出的信號脈沖幅值最大，脈沖頻率最高，且信號的重復性（SDSA＜40 μV，SDFR＜10次/ min，SD為標準方差）最好。按細胞密度12×104/cm2構建的心肌細胞傳感器從第2天開始就能檢測到微弱的信號，之后信號幅度快速增強，到第4天信號幅度達到最大，且可維持2 d～3 d的信號平臺期（如圖3）。而細胞密度過低或過高所構建的心肌細胞傳感器，信號幅度都比較微弱，而且維持時間短。

圖3　細胞密度為12×104/cm2構建的心肌細胞傳感器時脈沖幅值隨時間的變化

以上研究結果表明，合適的細胞密度可使心肌細胞在MEA上快速生長分化，形成一片均勻分布、高度融合、同步搏動的單細胞層，心肌細胞最佳的種植密度為12×104/cm2。而細胞密度過低，會使細胞生長緩慢，密度過高會使細胞提前死亡，影響信號發放而無法記錄得到胞外場電位信號。

2.2石房蛤毒素（STX）的標準樣品檢測及分析

如圖4（a）所示為不同濃度STX（25 nmol/L、100 nmol/L、400 nmol/L、1 600 nmol/L）作用5 min后，心肌細胞電位傳感器記錄到的胞外場電位信號變化。從圖中可以觀察到心肌細胞電位傳感器對STX的響應模式呈現出濃度依賴性，即STX濃度越大，胞外場電位信號的電位幅值越小，脈沖頻率越慢。實驗結果可說了STX對心肌細胞的電活動有明顯的抑制作用。

從所測信號中，提取2個特征參數脈沖幅值、脈沖頻率。把添加毒素前的基線信號作為參照點，對特征參數進行數據歸一化處理，再進行數據統計分析。圖4（b）為不同濃度STX作用5 min，胞外場電位信號2個特征參數的統計分析結果。圖中顯示了25 nmol/L STX組的脈沖幅值與對照組相比有顯著性下降（p＜0.001，n=6），STX對特征參數脈沖幅值和脈沖頻率有明顯的濃度依賴性抑制作用，且呈現出了不同的濃度敏感性。

圖4　胞外場電位信號圖

心肌細胞電位傳感器的脈沖頻率對STX較敏感，圖5為脈沖頻率抑制率對STX濃度對數的線性關系圖。在低濃度范圍，STX對脈沖頻率的抑制作用微弱，隨著作用濃度的增大，STX對脈沖頻率的抑制作用不斷增強，且呈現出一定的線性規律。當濃度達到1600 nmol/L時，脈沖頻率幾乎被STX完全抑制。通過線性擬合分析，得出脈沖頻率對STX響應的線性范圍為1.39 log STX（nmol/L）～3.2 log STX （nmol/L），即25 nmol/L～1 600 nmol/L，經計算求得該電位傳感器對STX的檢出限為1.004 ng/mL。

圖5　STX作用5 min，脈沖頻率抑制率對STX濃度對數的線性關系

2.3貝肉實際樣品檢測

從市場和貝類養殖場（由浙江大學海洋學院佟老師提供）一共采集了6份貝肉樣品，對貝肉中的PSP毒素進行檢測。檢測前，采取PSP毒素提取方法對貝肉進行前處理。PSP毒素提取液經HPLC方法檢測后，發現6份樣品均不含毒素，因此采用加標的方式（向貝肉提取液中添加毒素標準品），以此來模擬實際染毒樣本。將配置好的STX加標毒素樣品溶液按照不同的添加量加入到心肌細胞中，并進行檢測。按照3.2所述的方法建立標準曲線并計算出所測加標樣品的檢出量。根據公式回收率=檢出量/添加量×100%，可得出加標樣品的回收率。從表1中可以看出，5份加標樣本所測得的回收率較好（86%～108.2%），說明了麻痹性貝類毒素可用心肌細胞電位傳感器方法進行檢測。

表1　心肌細胞傳感器檢測STX加標樣本

在上述實驗中，實驗結果表明了該電位傳感器對STX敏感，有良好的線性度和靈敏的檢出限，而且其檢出限均遠小于標準小鼠生物法的檢出限［25］（40 μg/100 g）。說明了心肌細胞電位傳感器可以用于STX的檢測。貝肉實際樣品的檢測結果也可說明了該心肌細胞傳感器具有較好的實際應用前景。

心肌細胞電位傳感器為毒素檢測提供了多元化的胞外場電位信號參數，可以用于分析毒素的毒性作用。心肌細胞電位傳感器可長期穩定記錄細胞外場電位信號且具備一致性，為毒素提供了較寬裕的檢測時間。因此心肌細胞電位傳感器有望成為新型麻痹性貝類毒素的檢測平臺。

3　結論

隨著海產品安全問題的加劇，對海洋生物毒素的檢測和分析工作越來越受到人們的關注和重視。目前標準的小鼠生物法和常規的HPLC法已難以滿足海洋毒素日常監測的需要。心肌細胞電位傳感器具備實時動態分析、無需專業人員等優點，是一項很有發展潛力的毒素檢測技術。

心肌細胞電位傳感器應用于STX的檢測分析。研究結果表明心肌細胞電位傳感器對這種毒素能做出了快速（5 min）而靈敏的響應。該電位傳感器成功實現了對STX的快速高靈敏檢測。而且通過貝肉實際樣品的檢測也驗證了該方法具有較好的實際應用效果。總之，心肌細胞電位傳感器檢測法具有簡便快速、檢出限低、重復性好等的優點。

綜上所述，心肌細胞電位傳感器檢測法，不僅具備了標準小鼠生物法的優勢：操作簡單、可以檢測某一類毒素的毒性，還從一定程度上克服了小鼠生物法的缺陷，具有檢出限低、重復性好等優勢。再者，心肌細胞傳感器高度穩定性可做于分析，。因此心肌細胞電位傳感器在麻痹性貝類毒素檢測分析中具有很大的應用前景，有望取代小鼠生物法。

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方佳如（1991-），女，浙江大學，碩士研究生，主要研究方向為細胞生物傳感器與免疫傳感器，cnjrfang@zju.edu.cn；

王平（1962-），男，浙江大學，教授，博士生導師，主要研究方向為傳感器與檢測技術、生物芯片與生物電子學、人工嗅覺與人工味覺等，cnpwang@zju.edu.cn。

Study on Marine Toxins Detection of Cardiomyocyte Potential Sensor*

FANG Jiaru，WANG Qin，LI Hongbo，SU Kaiqi，PAN Yuxiang，WANG Ping*
（Biosensor National Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China）

With the rapid development of modern industry，the threat from marine toxins to human health has become increasingly serious，especially the paralytic biological poison.This paper presents a new method of cellbased potential sensor to detect shellfish toxicity.The cardiomyocyte combined with microelectrode array（MEA）by microelectronic processing technique which construct a novel cardiomyocyte potential sensor.The sensor can not only real-time monitoring，but also could output good extracellular field potential signal with stability and consistency，which cardiomyocytes seeded on the MEA high-closely.By testing saxitoxin（STX）and analyzing the characteristics of signal parameters，the experimental results illustrate the STX have obvious inhibitory effect for electrical activity of cardiomyocyte.And the peak potential amplitude and frequency have obvious inhibition of concentration dependence，and presented the different concentration sensitivity.The LOD（limit of detection）of conventional standard laboratory toxicity detection on mouse bioassay method is 40 μg/100 g，while the LOD and detection range of cardiomyocyte potential sensor is 1.004 ng/mL and 25 nmol/L～1 600 nmol/L，respectively.By comparative experiments，this method has great LOD and the detection is relatively simple and easy to fit standardization.With further improvement，the method has good prospects for development on detection rapidly toxicity of marine toxins.

cell-based biosensor；microelectrode array；marine toxins；cardiomyocyte potential detection；cell field potential signal

R318

A

1004-1699（2016）08-1127-06

EEACC：7230J10.3969/j.issn.1004-1699.2016.08.001

項目來源：海洋公益項目（201305010）

2015-12-16修改日期：2016-03-26