豬基因PCR-SSCP分析條件優化的研究

劉燕河南農業職業學院

豬基因PCR-SSCP分析條件優化的研究

劉燕
河南農業職業學院

PCR-SSCP技術作為一種區分檢測基因組之間微小差異的有效方法，具有快速、簡便、靈敏和適用于大量樣品篩選的特點。但影響基因測驗的因素很多，為探討豬基因PCR-SSCP分析的優化條件，經過反復對照實驗發現，在凝膠濃度12%，電壓4℃120v12h或室溫下250v10min后120v10h，甘油濃度0%，電泳溫度4℃等條件下效果最佳，條帶最清晰。

豬PCR-SSCP條件優化

單鏈構象多態性 （sing1e strand conformation，SSCP）在分子標記領域和基因圖譜的構建方面很受研究者的青睞，但試驗效果易受諸多因素的影響［1,2］。此次實驗根據目前國內外實驗室和作者所積累的經驗，對豬基因的PCR產物進行SSCP分析的試驗條件進行了研究，主要從凝膠的濃度、電壓的大小、甘油的濃度及溫度的高低等因素出發，進行分析比較，旨在從中篩選出一種效果比較理想的實驗條件，以提高該方法對豬基因突變檢測的成功率，為進一步深入相關研究建立基礎［2,3］。

一、試驗時間及地點

2014年8月1日～2015年6月1日牧業工程學院生物分子公開實驗室。

二、材料與方法

1.材料

（1）DNA提取試劑黃泛區南廠杜洛克豬血樣加ADE抗凝,（標號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）、5M/LKI溶液、氯仿∶異戊醇（24∶1）、生理鹽水、去離子水、異丙醇、70%預冷酒精、無水乙醇、一倍TE緩沖液等。

（2）PCR試劑及檢測試劑Taq酶、引物1、引物2、10×buffer、dNTP，Agarose（瓊脂糖）TAE緩沖液、EB染料、1oading Buffer染色劑等。

（3）PAGE凝膠試劑30%Acry1amide、5×TBE、10%過硫酸銨 （AP）、TEMED,20%NaOH、0.1%硝酸銀、1% TBE、甲醛、醋酸等。

（4）主要儀器。離心機（博勵行儀器有限公司,D-37520）、電子萬用爐（天津市泰斯特儀器有限公司）、PCR儀（PTC-100，MJ Research，INC）、DYY-Ⅲ型電泳儀（北京六一儀器廠）、立式電泳槽（北京六一儀器廠）、凝膠成像系統（Ge1-Logic100，Kodak）、玻板、電熱恒溫鼓風干燥箱（天津市華北實驗儀器有限公司,型號101-2s）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海伸安醫療器械廠,LD2X-408Ⅰ型）等。

2.主要方法

（1）DNA提取。①冷凍抗凝全血在室溫下溶化后混勻，取300u1移至EP管中，加入1m1無菌雙蒸水來回倒轉十次溶解紅細胞，13000r/min離心5min,棄上清，重復兩次。②棄上清，加入1m1 0.9%的生理鹽水，混勻，洗滌白細胞。13000r/min,離心5min棄上清。③向沉淀中加入100u1 5mo1/L碘化鉀溶液，漩渦振蕩30s,加入0.9%的生理鹽水300μg，然后立即加入450mg氯仿：異戊醇混合溶液 （24∶1），充分混勻10min,13000r/min,離心5min。④取上清到另一EP管中，加等體積氯仿：異戊醇（24∶1），輕輕混勻，13000r/min，離心5min。⑤取上清到另一EP管中，加入等量異丙醇或兩倍體積的無水乙醇，充分混勻，見有白色絮狀物即為DNA,常溫沉淀30min～1h。⑥加入預冷的200mg70%乙醇和無水乙醇，洗滌DNA,10000r/min離心3min，重復一次。⑦棄上清，待DNA晾干，加入50mg雙蒸水，過夜溶解DNA，-20℃保存備用。

（2）PCR擴增反應體系及條件。①18mg的反應體系：模板3u1，DNTP：2.5u1,buffer：2.5u1，引物上下個：0.8u1×2=1.6u1，Taq：0.4u1,水：11u1。②PCR條件：預變性：94℃，5min；變性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：72℃，50s；保持10min。30個循環。③PCR產物檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的純度，取Agarose0.3g，25mgTAE緩沖液在電熱爐上加熱至沸1～2min，加入EB染料3u1，冷卻至不燙手，倒入加有點樣梳的制膠漕中，直到凝膠變為不透明時，取5u1PCR產物與2u16×1oading Buffer染料混勻，用點樣槍加入點樣孔中，90v電壓，30min后,紫外燈下檢查PCR產物的純度。結果如圖-1所示。

圖1

④PCR產物變性：加入變性劑在DNA熱變性儀中94℃變性10min，取出迅速放入冰盒中冷卻。

（3）SSCP分析：在研究以下條件時，其他條件保持一致。根據PAGE不同濃度配方表配制用0.1%硝酸銀溶液染色15min后，用蒸餾水再洗一次，直接用20%的氫氧化鈉溶液顯色約15min左右，最后直接用冰乙酸蒸餾水終止染色。

三、實驗結果與分析

1.凝膠的濃度

實驗中以豬血全基因組中的內含子3基因為試驗材料，用8%、12%和15%的凝膠電泳，經過銀染后比較發現12%的凝膠電泳的條帶較為清晰，效果最好，可用于SSCP分析（如圖2～4）。凝膠的組成見表1，電泳結果見圖-2-3-4。圖2的分析條件較為成熟。

圖2

圖3　

圖4

表1　不同濃度PAGE凝膠的配方表

2.電壓的大小

由于SSCP電泳凝膠的濃度較高，所以如果電泳電壓太大，如300v,則產熱量大，導致中間跑得快而兩邊較慢，使帶型成為弧形，有微笑效應（圖6），影響電泳效果。經過多次試驗比較，在室溫下，一般垂直平板，電泳電壓以250v10min，120v10h為宜。而在4℃時以低電壓為宜，時間為10～12h效果更好（如圖5）。

圖5

圖6

3.甘油或其他變性劑

凝膠中加入低濃度的變性劑，如5%～10%甘油，5%尿素或甲酰胺，10%二甲亞砜（DMSo）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因為輕微改變ssDNA的構象，增加分子表面積，降低了DNA的泳動率。甘油對不同樣品的SSCP條帶的泳動影響效果不一樣，它對某些條帶的泳動有促進作用，而對另一些則可能有抑制作用［4］，所以有些變異序列只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。本實驗發現甘油濃度為0%效果更明顯。

4.電泳溫度

溫度恒定是SSCP分析的關鍵因素，在本實驗中，發現室溫下的條帶明顯差于4℃。室溫下溫度較高，在電泳時，溫度還會繼續升高，試驗結果顯示在室溫下條帶有“微笑”狀。為確保電泳溫度相對恒定，應減少凝膠厚度，降低電壓，采取有效的空氣冷卻或循環水冷卻等措施，也可在冰箱的冷藏柜中電泳。在沒有冷卻裝置的情況下，可在開始的10min內用較高的電壓如250v，然后在降低電壓到120v電泳10h，也可收到滿意的條帶。

5.豬基因PCR-SSCP試驗的最佳優化條件

經過反復的實驗及對照，豬基因PCR-SSCP試驗的最優條件為：凝膠濃度12%，甘油濃度0%，電壓為室溫下在開始的10min內用較高的電壓如250v，然后在降低電壓到120v電泳10h,但是4℃時低電壓（120v）為宜，溫度4℃時染色后條帶細而清晰，能夠準確分辨各基因型（如圖7）。

圖7

四、討論

1.凝膠濃度

PCR產物電泳后條帶必須保證單一無雜帶，這是PCR-SSCP成功的基本和前提條件。魏太云等認為，凝膠濃度只影響電泳遷移率，通常選用的凝膠濃度6%～12%，凝膠濃度越高DNA泳動越慢，各單鏈之間距離越短［11］。而本實驗恰恰說明凝膠濃度和交聯度對實驗影響最大，因為凝膠濃度和交聯度決定了凝膠的孔徑。孔徑小，單鏈之間就能夠分得更開，從而使條帶更清晰。凝膠的厚度盡量要薄，可減少在泳動過程中產生的熱量而影響實驗效果。

2.電壓大小

為了使單鏈DNA保持一定的穩定立體構象，SSCP應在低溫下進行（一般4～15℃之間）。在電泳過程中，電壓過高是引起溫度升高的主要原因。溫度過大會導致出現“微笑”條帶或其他問題。另外，凝膠薄一點更好，凝膠越厚，電泳時產生的熱量就越大。因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時，開始的 5min應用較高的電壓（250V），以后用低壓進行電泳。這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高。本實驗中，PCR產物經變性電泳后，出現的條帶較多，主要因為有的單鏈形成多種構象。如果上樣量一定，出現的條帶越多，那條帶就會越淡，所以應該加大上樣量并提高PCR產物和變性緩沖液的比例。

3.甘油濃度

目前普遍對加不加甘油的看法是：有的片段加，對遷移有促進作用；有的片段不加，反而促進遷移。有些學者認為甘油的濃度在5%～10%時SSCP分析的結果較好［5］。本實驗中，發現在同等條件下0%甘油濃度的凝膠中條帶整齊、緊湊，帶型特征明顯，甘油濃度增加反而會使條帶不清或帶型特征不明，在膠中的遷移距離縮短。所以，在SSCP分析過程中是否添加甘油、濃度究竟多大，應根據不同基因片段進行調整。

4.溫度高低

本次試驗中分離物條帶的分離程度受溫度變化的影響很大，由于在電泳時，溫度會升高，為確保電泳溫度相對恒定，應減少凝膠厚度，降低電壓，采取有效的空氣冷卻或循環水冷卻等措施，也可在冰箱的冷藏柜中電泳。如果沒有冷卻裝置，則可在開始的幾分鐘用較高的電壓（250v），然后在降低電壓到100v左右開始電泳，這樣既能使單鏈的DNA初步分開，又不使溫度升高。

［1］魏太云，林含新，謝聯輝．PCR-SSCP分析條件的優化［J］．福建農林大學學報，2002，（3）：22-25．

［2］何俊,曲湘勇,黃生強等.鵝基因PCR-SSCP分析條件優化的研究［J］.中國畜牧獸醫,2006.

［3］歐陽建華,黃建安.PCR-SSCP技術的研究進展［J］.上海畜牧獸醫通訊,2002.

［4］李玉梅,姚紀元,吳靜等.PCR-SSCP技術的研究及應用進展［J］.生物技術通報,2007.

［5］蔡輝國,陳佩貞,張立冬等.PCR-SSCP分析實踐［J］.生物化學與生物物理進展,1995.