黃芪注射液對高糖介導的腎小管上皮細胞NF-κB表達的影響

梅莎莎，宋恩峰，項　瓊

（武漢大學人民醫院中醫科，武漢　430060）

黃芪注射液對高糖介導的腎小管上皮細胞NF-κB表達的影響

梅莎莎，宋恩峰，項瓊

（武漢大學人民醫院中醫科，武漢430060）

［目的］觀察黃芪注射液對高糖環境下腎小管上皮細胞（HK-2）核轉錄因子κB（NF-κB）蛋白表達的影響。［方法］傳代培養人近曲腎小管上皮細胞，細胞用無血清培養基同步化24 h后，將細胞分為5組：低糖對照組、高糖組、高糖+不同濃度黃芪注射液組（2、20、200mg/L），每組設3個復孔。將細胞置于37℃恒溫培養箱中培養至24、48、72 h，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，Western Blot方法測定細胞中NF-κB蛋白表達量。［結果］黃芪注射液干預組與高糖組細胞相比，細胞生長狀態較好，NF-κB蛋白表達量降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性。［結論］高糖環境下培養HK-2細胞可導致細胞生長狀態變差，NF-κB蛋白表達增加，黃芪注射液對細胞有保護作用，能降低NF-κB蛋白表達。

糖尿病腎病；腎小管上皮細胞；核轉錄因子-κB；黃芪注射液

近年來糖尿病腎?。―N）嚴重威脅著人們的健康。腎小管病變在糖尿病腎病的發病機制中有重要作用，而高血糖可作為獨立的危險因子損傷腎小管。體外高糖培養腎小管上皮細胞（HK-2），可激活核轉錄因子-κB（NF-κB）的表達，調節炎性介質，是DN炎性反應的中心環節，也是炎癥細胞積聚的重要特征，其表達量的增加可能誘導腎小管上皮細胞的凋亡，致使腎小管損傷。中醫學認為糖尿病腎病發病機制為本虛標實之癥，治療以扶正祛邪，攻補兼施為主［1-3］。研究表明黃芪對NF-κB具有抑制作用，能夠降低腎炎大鼠腎皮質NF-κB的表達，改善腎臟組織病理學損傷［4］，但黃芪注射液能否降低HK-2細胞NF-κB的表達尚不清楚。本文用黃芪注射液對高糖環境下HK-2細胞進行干預，探討其是否降低NF-κB蛋白表達，保護HK-2細胞，從而起到治療糖尿病腎病的作用。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮細胞株（HK-2），武漢大學人民醫院腎內科實驗室惠贈；DMEM高糖、低糖培養液，吉諾生物醫藥技術有限公司；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；0.25%胰酶溶液、青-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS），吉諾生物醫藥技術有限公司；苯甲基磧酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天；GAPDH抗體，杭州賢至生物有限公司；HRP標記羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司；NF-ΚBp65，Bioworlde；黃芪注射液，哈爾濱圣泰制藥股份有限公司，國藥準字Z23020820。

1.2方法

1.2.1細胞培養HK-2細胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM低糖培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養。倒置顯微鏡觀察細胞鋪滿瓶底約80%～90%時可進行細胞傳代。

1.2.2細胞分組將細胞移至六孔板中培養至細胞融合至80%，將培養基換成無血清DMEM低糖培養基培養24 h后，棄去無血清培養基。將細胞分為5組：1）低糖對照組（A組）：低糖培養基含D-葡萄糖5.5 mmol/L；2）高糖組（B組）：高糖培養基含D-葡萄糖25mmol/L；3）高糖+黃芪注射液小劑量組（C組）：高糖培養基+2mg/L黃芪注射液；4）高糖+黃芪注射液中劑量組（D組）：高糖培養基+20mg/L黃芪注射液；5）高糖+黃芪注射液大劑量組（E組）：高糖培養基+200mg/L黃芪注射液，每組設3個復孔。于37℃培養箱中培養24、48、72 h，收集細胞及細胞上清液用于后續實驗。

1.2.3細胞形態觀察倒置相差顯微鏡觀察HK-2細胞形態變化。

1.2.4Western Blot檢測NF-κB蛋白表達收集細胞，配制裂解液提取蛋白，測定蛋白濃度，將蛋白上樣進行電泳。電泳結束后將凝膠移入轉膜緩沖液固定，按轉膜電極板陰極至陽極方向，依次疊放濾紙、電泳凝膠、膜及濾紙。轉膜完畢后將膜置人含5%（W/V）脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）中，室溫下封閉1 h。封閉液稀釋一抗，室溫下反應2h，或4℃反應過夜，用PBST洗滌3次，每次5min用封閉液稀釋熒光二抗，室溫下反應30 min，用PBST洗滌3次，每次5min。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數分鐘。等熒光條帶顯示清楚后，將多余的底物液用濾紙吸出，并將保鮮膜覆蓋其上，待X膠片壓片好后，依次放入顯影液、定影進行顯影和定影。

1.3統計學方法采用SPSS 18.0軟件處理。所有的數據均以均數±標準差表示，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HK-2細胞形態變化A組細胞呈多邊形生長，貼壁緊密，呈鋪路石樣排列，細胞間緊密連接，有較強折光性，分裂相明顯。B組細胞呈梭形生長，貼壁性差，排列不規則，細胞連接松散，折光性差，分裂相及數量明顯減少。C組細胞形態較B組變化不大，貼壁性較差，折光性較差。D組細胞成梭形，呈小片散在分布，折光性較弱，細胞數量較B組多，細胞連接較松散。E組細胞成梭形，貼壁較B組好，折光性減弱，細胞數量較多，連接較緊密。見圖1。

2.2細胞NF-κB的表達HK-2細胞在24、48、72h 3個時間段A組中NF-κB蛋白表達量低，與B組有顯著差異（P＜0.05），表明高糖環境能誘導HK-2細胞NF-κB蛋白表達量的增加。24 h時間段E組與B組比較有顯著性差異（P＜0.05）。48 h和72 h兩時間段C、D、E組與B組比較均有顯著性差異（P＜0.05），C、D、E組之間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。以上結果表明，E組24 h能夠明顯抑制NF-κB蛋白表達。E、D、C組48、72 h均能夠明顯抑制NF-κB蛋白表達，且E、D、C 3組之間也有明顯差異。見表1。

24、48、72 h NF-κB蛋白表達以A、E、D、C、B依次增加，柱狀圖中可見柱高依次增加，Western條帶顏色依次加深，寬度增加。見圖2、圖3。

圖1 48 h各組HK-2細胞形態學改變

表1 不同濃度黃芪注射液對HK-2細胞NF-κB蛋白表達的影響

表1 不同濃度黃芪注射液對HK-2細胞NF-κB蛋白表達的影響

注：與B組比較，*P＜0.05；與E組比較，#P＜0.05；與D組比較，ΔP＜0.05。

組別24 h　48 h　72 h A組　0.271 3±0.048 8　0.297 0±0.061 5　0.303 7±0.096 8 B組　0.606 3±0.091 9　0.854 0±0.030 6　0.921 7±0.057 1 C組　0.537 7±0.103 3#　0.617 7±0.009 1*#Δ　0.578 7±0.031 3*#ΔD組　0.462 3±0.071 2　0.514 0±0.022 3*#　0.469 7±0.022 7*#E組　0.371 0±0.075 0*　0.408 3±0.068 3*　0.345 3±0.031 9*

3　討論

近年來隨著糖尿病發病率的不斷升高，其常見并發癥糖尿病腎病發病人數也不斷上升，并引起了人們的關注。腎小球、腎小管、腎間質的損傷是糖尿病腎病的發病機制，其中腎小球損傷是DN的主要發病機制，近年研究發現腎小管損傷可能早于腎小球損傷，在DN患者蛋白尿排泄率正常時可能就已經發生了腎小管的損傷。腎間質纖維化和腎功能與腎小管病變聯系密切，其密切程度優于腎小球硬化與腎功能的關系。

圖2　依次為24、48、72 h不同濃度黃芪注射液對HK-2細胞NF-κB蛋白表達的影響

在糖尿病腎病發病過程中腎小管損傷的發生主要見于以下幾方面：1）腎小管上皮細胞的凋亡。有研究表明對DN患者取腎臟組織進行病理檢查發現腎小管及腎小球細胞都有明顯凋亡，腎小管的凋亡程度與糖尿病病程及低密度脂蛋白膽固醇有相關性［5］。2）糖尿病腎病發病過程中會產生大量細胞因子及細胞產物，可導致腎小管上皮細胞肥大，腎小管基底膜受損及細胞外基質堆積，這些細胞產物及因子主要包括血管緊張素Ⅱ、活性氧簇（ROS）、晚期糖基化終末產物、轉化生長因子β等。3）炎癥反應。炎癥反應對腎小管及腎間質的損傷有重要作用。4）腎小管間質纖維化。各種促進腎小管纖維化因子對糖尿病腎病發生發展有重要作用，如結締組織生長因子（CTGF）、NF-κB、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）等。

圖3　依次為24、48、72h不同濃度黃芪注射液對HK-2細胞NF-κB表達的影響

腎小管上皮細胞的損傷在多種腎臟病的進展中發揮著重要作用［6］，該細胞被各種因素激活后可產生大量細胞因子及炎癥介質，如白介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、黏附分子等［7］。NF-κB在腎小管損傷中表達明顯增加，可調控免疫因子及轉錄因子的表達，參與炎癥、纖維化及細胞凋亡的過程。在腎臟組織中NF-κB主要表達于腎小管上皮細胞及間質細胞［8］。NF-κB在細胞中為無活性狀態，當細胞受到刺激后，即以激活狀態存在，并發揮其調控作用［9］。糖尿病腎病發病過程中NF-κB為炎癥信號的主要傳導通路［10］。有研究發現抑制NF-κB信號傳導通路，可減輕糖尿病小鼠腎臟病變［11］，而激活NF-κB信號傳導通路，則可誘導炎癥因子的釋放及巨噬細胞浸潤，促進糖尿病腎病的發病進程，其中高糖環境是常見的激活該通路的因素之一［12］。

在糖尿病腎病發病過程中高血糖是一個重要的獨立危險因子，有研究證明長期高血糖誘發糖尿病腎病，從20世紀80年代開始的兩個研究—糖尿病前瞻性研究和糖尿病控制與并發癥實驗都得出結論：控制高血糖可以減少DN的發生［13-14］。常規體外培養近端腎小管上皮細胞發現NF-κB蛋白主要表達于腎小管上皮細胞的胞漿中，且為無活性狀態，而在培養基中加入高濃度葡萄糖后發現NF-κB蛋白表達活性增強，并與培養的時間成正相關，表明高糖能夠誘導NF-κB蛋白及基因的表達［15］。NF-κB表達的增加可能誘導腎小管上皮細胞的凋亡，致使腎小管損傷。本實驗中高糖組NF-κB蛋白表達及細胞凋亡率明顯較正常對照組高，與文獻報道一致。

黃芪是是補氣的傳統中藥。黃芪歸脾、肺經，性味甘溫，有益氣固表，托毒生肌，利水消腫等作用。黃芪主要用于治療氣虛乏力，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，癰疽難潰，久潰不斂，血虛萎黃，內熱消渴。在現代醫學領域主要治療糖尿病、慢性腎炎、冠心病、心力衰竭、腦梗死等。藥理實驗表明黃芪能增加機體免疫力，還具有清除體內自由基抗衰老作用，對肝臟也有一定的保護作用，對人體多個系統都有影響，如泌尿系統、內分泌系統、心血管系統、血液系統及中樞神經系統。

黃芪注射液的有效成分是黃芪甲甙，從黃芪草本植物中提取出來。黃芪的主要有效成分是黃酮類、氨基酸類、多糖類、皂苷類等，但黃芪注射液的具體組成成分還不明確，現在大多數研究認為皂苷類、黃芪多糖及大量微量元素是黃芪注射液的有效治療成分，其中多糖成分是重要的免疫活性物質，微量元素可以調節機體的元素失調。黃芪注射液的治療作用與黃芪基本相似，有益氣養元、扶正祛邪、養心通脈、健脾利濕等作用?？捎糜谥委煵《拘孕募⊙?、心力衰竭、免疫力低下導致的慢性活動性肝炎、慢性肝炎、白細胞減少癥、血小板減少性紫癜、慢性腎炎、腎病綜合征、糖尿病腎病等。

研究發現黃芪注射液能夠明顯降低腎炎大鼠腎皮質NF-κB的表達［16］。新生兒窒息血清誘導人近曲小管上皮細胞損傷后，NF-κB核轉位增加顯著，用黃芪注射液干預后能夠明顯抑制NF-κB的激活，降低其表達［17］。黃芪注射液不僅對腎臟組織有抑制NF-κB的作用，對其他組織細胞也有抑制作用。黃芪注射液可通過提高肺組織熱休克蛋白70的表達，抑制NF-κB活性，并下調一系列炎癥因子TNF-α、IL-6，以減輕炎癥反應，起到對肺臟的保護作用［18］。黃芪注射液能夠明顯抑制大鼠胰腺炎胰腺組織中NF-κB蛋白表達，抑制急性胰腺炎的發展及損傷［19］。黃芪注射液還能夠抑制膿毒血癥大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白的表達，對大鼠腎臟有保護作用［20］。

本實驗用高糖培養基培養HK-2細胞，不同時間點測定細胞內NF-κB蛋白含量，以此證明高糖環境能誘導HK-2細胞中NF-κB蛋白表達，高糖環境下HK-2細胞形態也發生明顯變化，A組與B組比較發現細胞在高糖環境下生長狀態較低糖組差，生長緩慢，貼壁性差，細胞密度減小，分裂相減少，折光性減弱，形態由正常鋪路石樣變為長梭形。表1可見在24、48、72 h 3個時間點，B組NF-κB蛋白表達較A組明顯增加，表明高糖環境能夠誘導NF-κB蛋白表達。黃芪注射液干預組則表現為對NF-κB蛋白表達的抑制作用。

黃芪注射液可通過抑制NF-κB表達，對HK-2細胞起到保護作用，但黃芪注射液作為中藥提取物，其成分復雜，對HK-2細胞有保護作用的成分并不十分清楚，所以還有待進一步研究，以明確黃芪注射液的具體作用機制，為臨床治療糖尿病腎病提供依據。

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Influenceof Astragaluson expression of nuclear factor-κB induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelialcells

MEISha-sha，SONGEn-feng，XIANGQiong
（Departmentof traditional Chinesemedicine，Renmin HospitalofWuhan University，Wuhan 430060，China）

［Objective］To investigate the influence of Astragalus on expression of nuclear factor-κb（NF-κB）induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells（HK-2）.［M ethods］Human renal proximal tubular cellswere cultured and divided into five groups:low glucose as control group；high glucose group；astragalus pretreatment group with concentration of 2μg/mL，20μg/mL and 200μg/mL.Each group has three samples. Culturing in 37℃ incubator for 24 hours，48 hours and 72 hours，inverted microscope observe the cells.The expression levelof NF-κB protein wasdetected byWestern blotting.［Results］Compared with high glucose groups，the drug intervention groups groupedmore better，expressed NF-κB protein levelwas lower（P＜0.05），and the effect of astragaluswere showed in dose-dependentmanner.［Conclusion］High glucosemay induce HK-2 cells to express NF-κB and decrease growth.Astragalus has protective effect to HK-2 cells by inhibiting HK-2 cells expression of NF-κB.

diabetic nephropathy；renal tubularepithelialcell；nuclear factor-κB；Astragalus

R587.1

A

1673-9043（2016）04-0253-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.04.09

梅莎莎（1986-），女，碩士研究生，研究方向為糖尿病腎病的發病機制及中西醫結合治療。

宋恩峰，E-mail:songef@126.com。

2016-04-15）