芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)血管新生及穩(wěn)定的影響*

張密霞，秦袖平，莊朋偉，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193）

·實(shí)驗(yàn)研究·

芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)血管新生及穩(wěn)定的影響*

張密霞，秦袖平，莊朋偉，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］探討芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)血管新生及穩(wěn)定的影響。［方法］三維培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)，分為正常組、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）組、芪參益氣滴丸組、VEGF+芪參益氣滴丸組，分別加入正常培養(yǎng)基及分別含10μg/LVEGF、25mg/L芪參益氣滴丸、10μg/LVEGF+25mg/L芪參益氣滴丸的正常培養(yǎng)基，每組3復(fù)孔。從第3天開始，隔天計(jì)數(shù)新生血管的總分支數(shù)、總長度、平均長度、最長長度，直至新生血管退化，比較各組對血管新生及穩(wěn)定的影響。［結(jié)果］正常組主動脈環(huán)前3 d血管逐漸長出，第3～7天新生血管長度增加，數(shù)量變化不明顯，7 d后，新生血管數(shù)量和長度均降低，此后逐漸退化；與正常組比較，各用藥組均能促進(jìn)新生血管發(fā)芽（1～3 d）及3～7 d持續(xù)生長。7 d后，雖各組新生血管總分支數(shù)（除芪參益氣滴丸組第13～15天外）、總長度、平均長度和最長長度較正常組均有增加趨勢，但單用芪參益氣滴丸則血管迅速退化，單用VEGF血管數(shù)量及長度不再明顯增加，且新生血管結(jié)構(gòu)在第11天明顯破壞，并逐步退化，而芪參益氣與VEGF滴丸合用能使新生血管在第7～13天持續(xù)穩(wěn)定生長，并延緩其退化。［結(jié)論］芪參益氣滴丸能促進(jìn)三維培養(yǎng)主動脈環(huán)血管新生，但維持時間較短，與VEGF合用有協(xié)同作用，可促進(jìn)血管新生，維持持續(xù)生長較長時間，并延緩新生血管退化。

芪參益氣滴丸；主動脈環(huán)；血管新生及穩(wěn)定

芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七和降香組成，具有益氣通脈、活血、止痛的功效，用于治療胸痹心痛，屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的冠心病心絞痛范疇。有研究報(bào)道芪參益氣浸膏和提取溶液給藥4周可改善心肌梗死大鼠心功能、縮小梗死面積、促進(jìn)梗死周邊區(qū)血管新生［1-2］。促血管新生治療后，缺血區(qū)新生血管密度增加、梗死面積減小，心肌細(xì)胞壞死和凋亡的程度降低、射血分?jǐn)?shù)增加、心功能得以改善［3-4］。為進(jìn)一步探討芪參益氣滴丸促進(jìn)血管新生的作用及其作用特點(diǎn)，筆者動態(tài)觀察芪參益氣滴丸對體外培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)不同時間點(diǎn)新生血管的總長度、總分支數(shù)、平均長度和最長長度，以期闡述該藥對血管新生的速度及維持時間的影響，明確其作用特點(diǎn)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

10*MEM培養(yǎng)基：Gibco，批號1268317；MCDB131：Gibco，批號1644017；1640培養(yǎng)基：Hyclone，批號NXC0596；重組人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）：Millipore，批號2301935；鼠尾膠：SERVA，批號：131254-2。芪參益氣滴丸：天津天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批號150208。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1血管段培養(yǎng)及鑒定參照文獻(xiàn)［5］標(biāo)準(zhǔn)。冰浴中按以下比例配制鼠尾膠工作液：2g/L鼠尾膠750μL、10*MEM 100μL、1.4%碳酸氫鈉（NaHCO3）150μL、混勻，以1mol/L氫氧化鈉（NaOH）適量（約10μL）調(diào)節(jié)pH值至7.4，混勻。將配制好的工作液冰浴靜置30min，48孔板每孔加鼠尾膠工作液200μL，培養(yǎng)箱內(nèi)放置30min待其凝膠，備用［5］。

取100 g SD大鼠，脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，無菌取出胸主動脈，于無菌含1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中剝離血管周圍結(jié)締組織，沖出管腔內(nèi)血液，將主動脈切為2～3mm長的動脈環(huán)，1640培養(yǎng)基洗5遍。將主動脈環(huán)以管腔平行于培養(yǎng)板底面置于上述備好的48孔板內(nèi)的凝膠上，在其上再加200μL鼠尾膠工作液，培養(yǎng)箱內(nèi)放置30min，凝膠后，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔2 d換液1次。在新生血管生長最佳時，去除主動脈環(huán)，將三維培養(yǎng)物用家兔凝血塊包埋，將此包埋物沿血管環(huán)縱軸常規(guī)石蠟切片，CD31免疫組織化學(xué)染色鑒定。

2.2芪參益氣滴丸對培養(yǎng)血管段血管新生及穩(wěn)定的影響將三維培養(yǎng)物分為正常組（正常培養(yǎng)基：含1%PS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1%1.1mol/LNaHCO3的MCDB131）、VEGF組（含10μg/LVEGF的正常培養(yǎng)基）、芪參益氣滴丸組（含25mg/L芪參益氣滴丸的正常培養(yǎng)基，簡稱QS組）、VEGF+芪參益氣滴丸組（含10μg/LVEGF+25mg/L芪參益氣滴丸的正常培養(yǎng)基，簡稱VEGF+QS組），每組3復(fù)孔。每3 d換液1次。從第3天開始，倒置非相差顯微鏡照像，隔天計(jì)數(shù)新生血管的總分支數(shù)、總長度、平均長度、最長血管長度［5］，直至新生血管退化，比較各組對血管新生及穩(wěn)定的影響。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。重復(fù)測量資料間比較采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1大鼠主動脈環(huán)三維培養(yǎng)物新生血管鑒定于主動脈環(huán)三維培養(yǎng)物培養(yǎng)第5天，CD31免疫組織化學(xué)染色鑒定，結(jié)果表明長出的管樣結(jié)構(gòu)主要由內(nèi)皮細(xì)胞組成，其中心具有管腔樣結(jié)構(gòu)，表明新生的管樣結(jié)構(gòu)為新生血管，見圖1。

圖1　三維培養(yǎng)物的CD31免疫組織化學(xué)染色鑒定

3.2芪參益氣滴丸對大鼠主動脈環(huán)三維培養(yǎng)物血管新生與穩(wěn)定的影響正常培養(yǎng)第1天，可見有細(xì)胞從主動脈環(huán)橫斷面長出，呈散在生長，未見有明顯新生血管樣結(jié)構(gòu)；第2天，有少量管樣結(jié)構(gòu)長出；第3天，可見大量新生血管，較第2天明顯增長；第3～7天總分支數(shù)無明顯變化，而總長度、平均長度、最長長度持續(xù)增加；第9天總分支數(shù)、總長度下降，平均長度、最長長度仍持續(xù)增加，新生血管逐漸增粗；第11～15天總分支數(shù)、總長度下降，平均長度、最長長度無明顯變化，鏡下管樣結(jié)構(gòu)逐漸崩解。表明培養(yǎng)前3 d為血管發(fā)芽期，5～7 d主要表現(xiàn)為血管長度增加，第9天開始血管增粗，但也開始退化，此后血管迅速退化。

主動脈環(huán)培養(yǎng)前3 d為血管出芽階段。在第3天，VEGF+芪參益氣滴丸組和芪參益氣滴丸組與正常組比較總分支數(shù)明顯升高（P＜0.05），VEGF組較正常組有增加趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；芪參益氣滴丸組總長度、平均長度、最長長度明顯高于正常，VEGF+芪參益氣滴丸組和VEGF組有增加趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明在此階段各用藥組均能促進(jìn)新生血管發(fā)芽，但以芪參益氣滴丸作用最強(qiáng)。

第3～7天為新生血管生長階段。與正常組比較，各用藥組均有增加新生血管總分支數(shù)、總長度、平均長度、最長長度的趨勢，各組差別不明顯。

第7天之后，新生血管逐漸進(jìn)入增粗、形成管腔，逐漸成熟和退化階段。與正常組比較，VEGF、芪參益氣滴丸、VEGF+芪參益氣滴丸組第7～15天均有增加新生血管總分支數(shù)（除芪參益氣滴丸第13天、第15天外）、總長度、平均長度、最長長度的趨勢，其中部分時間點(diǎn)與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從各指標(biāo)的變化規(guī)律來看，VEGF組的新生血管數(shù)量和長度第7～15天維持在較高水平，未再明顯增加，鏡下觀察第9天新生血管明顯增粗，11 d后雖新生血管數(shù)量和長度無明顯變化，但管樣結(jié)構(gòu)逐漸崩解，退化，此后退化更明顯。芪參益氣滴丸組7 d后血管數(shù)量和總長度迅速降低，鏡下觀察變化規(guī)律與正常組相似。VEGF+芪參益氣滴丸在7～13 d維持血管數(shù)量無明顯變化的同時，可支持血管持續(xù)生長，使其總長度、平均長度、最長長度逐漸增加，第15天血管數(shù)量雖未明顯降低，但最長長度降低，鏡下觀察，第7天新生血管明顯增粗，第11天可見管腔樣結(jié)構(gòu)，此后新生血管有退化現(xiàn)象，但較其他組退化減慢并可見有新的血管芽長出。

以上結(jié)果表明，25mg/L芪參益氣滴丸、10μg/L VEGF、10μg/LVEGF+25mg/L芪參益氣滴丸均能促進(jìn)體外三維培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)血管新生。其中芪參益氣滴丸、VEGF、VEGF+芪參益氣滴丸均能促進(jìn)培養(yǎng)血管環(huán)早期（1～3 d）新生血管發(fā)芽及持續(xù)生長（3～7 d）。但7 d后，單純應(yīng)用芪參益氣滴丸則血管迅速退化；單純用VEGF血管數(shù)量和長度不再明顯增加，且新生血管結(jié)構(gòu)在第11天明顯破壞，新生血管逐步退化；VEGF+芪參益氣滴丸合用能使7～13 d新生血管持續(xù)穩(wěn)定生長，并延緩其退化。見表1～4，圖2。

表1　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管總分支數(shù)的影響個

表1　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管總分支數(shù)的影響個

注：與正常組比較，*P＜0.05；與VEGF組比較，#P＜0.05；與EGF+ QS組比較，△P＜0.05，（下同）。

組別　　第3天第5天第7天　第9天第10天第13天第15天正常組　33±27*39±23 35±16　25±01*15±03*16±10*17±10* VEGF組　51±27*65±31 51±22　57±49*56±34*52±41*55±37* VEGF+QS組73±44*63±39 53±35　59±13*51±14*　51±19*53±20* QS組　81±43*68±53 71±48*36±23△24±09△　16±*7△17±*4#△

表2　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管總長度的影響μm

表2　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管總長度的影響μm

組別　　第3天　　第5天　　第7天　　第9天正常組　4 128±5059 05 475±4054　06 321±2 741 05319±　445 VEGF組　6 272±4618 11 436±6607*11 133±7 297 11409±12625 VEGF+QS組　9 860±7854 10 672±7213　13 142±11 430*15959±9225* QS組　12066±7802*11 175±7424　14484±10315*08706±2313*組別　　第11天　　第13天　　第15天正常組　03373±1 016　03 541±2146　3 401±2 297 VEGF組　12613±7 435*　11 350±8369*　14 601±9 840* VEGF+QS組11015±855*　18 730±12988*　18654±11 750* QS組　06221±2 339*#△　04 231±1773△　03 975±　442#△

表3　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管平均長度的影響μm

表3　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管平均長度的影響μm

組別　　第3天　第5天　第7天　第9天　第11天　第13天　第15天正常組　105±34 136±35 187±38230±26 222±26　230±37 200±39 VEGF組　120±30 181±98 210±114186±58 227±99　235±108 258±25△VEGF+QS組127±43 268±225 235±89267±116 227±80 349±129*334±97*#QS組　141±20*174±29 202±25286±123 266±4*273±52 244±25△

表4　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管最長長度的影響μm

表4　芪參益氣滴丸對培養(yǎng)大鼠主動脈環(huán)新生血管最長長度的影響μm

組別　　第3天　第5天　第7天　第9天　第11天　第13天　第15天正常組　295±146 387±132 401±171　473±27 379±337 446±92　425±146 VEGF組　313±110 520±312 717±477　549±274 559±199 646±287　640±133* VEGF+QS組464±193*448±174 657±238*665±181*688±244*812±230*677±262* QS組　478±203*528±85*636±124*567±65*492±12△568±99*△594±44*

4　討論

正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞更新率很低，血管細(xì)胞，特別是內(nèi)皮細(xì)胞表面上雖然并不活躍，但它們的物質(zhì)代謝相當(dāng)活躍，它們產(chǎn)生細(xì)胞因子、黏附分子、生長因子、血管活性肽，對先天及細(xì)胞免疫、器官和組織修復(fù)、心血管、肺、腎功能均有影響。在生理、病理刺激，比如當(dāng)心肌梗死、缺血缺氧等發(fā)生時，內(nèi)皮細(xì)胞能很快的被誘導(dǎo)復(fù)制［6］，形成新生血管。但是，新生血管數(shù)量少及新生血管結(jié)構(gòu)和功能的異常是許多缺血性疾病如心肌梗死、退行性黃斑病變和糖尿病下肢缺血壞死等的共同的病理特點(diǎn)［7-8］。治療性的血管發(fā)生是以可控的手段目的性的給與相關(guān)生長因子和基因以促進(jìn)具有生理功能的新生血管形成。

芪參益氣滴丸臨床主要用于治療胸痹心痛，屬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的冠心病心絞痛范疇。Zhang等［2］通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)，芪參益氣滴丸能提高左心室心肌VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和血小板衍生生長因子（PDGF-B）的mRNA和蛋白水平，促進(jìn)血管新生，減少心梗面積。周鈞等［9］發(fā)現(xiàn)芪參益氣浸膏能動員急性心肌梗死大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)使其數(shù)量增加并促進(jìn)梗死周邊區(qū)血管新生，限制梗死面積。

為進(jìn)一步探討芪參益氣滴丸促進(jìn)血管新生的特點(diǎn)，通過對體外三維培養(yǎng)的大鼠主動脈環(huán)，加入VEGF、芪參益氣滴丸、芪參益氣滴丸合并VEGF，對血管新生及其維持時間進(jìn)行了動態(tài)觀察，結(jié)果表明：芪參益氣滴丸與VEGF的早期促發(fā)芽和其后的一段時間維持新生血管生長的作用相似。但作用7 d后，單純應(yīng)用芪參益氣滴丸并不能長久維持新生血管的穩(wěn)定生長，但若與VEGF合用，則具有協(xié)同作用，能夠促進(jìn)新生血管的持久穩(wěn)定，且可見管腔樣結(jié)構(gòu)。在心肌梗死等缺血性疾病，病灶部位本身存在VEGF升高，推測給予芪參益氣滴丸有和VEGF協(xié)同，促進(jìn)血管新生及穩(wěn)定的作用。這也與現(xiàn)有研究芪參益氣滴丸能促進(jìn)在體血管新生，減小梗死面積的研究結(jié)果相似。

綜上所述，芪參益氣滴丸能促進(jìn)三維培養(yǎng)主動脈環(huán)血管新生，但維持時間較短，與VEGF合用有協(xié)同作用，可促進(jìn)血管新生，維持持續(xù)生長較長時間，并延緩新生血管退化。

目前對于血管新生的機(jī)制的研究主要包括VEGF、bFGF/PDGF-BB/PDGFR-α、β通路、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）通路、Ang1-Tie2通路等方面［10-13］，筆者正在對體外三維培養(yǎng)不同時間點(diǎn)芪參益氣滴丸對這些通路的影響進(jìn)行檢測，以期探討芪參益氣滴丸上述促進(jìn)血管新生及穩(wěn)定的機(jī)制。

圖2　芪參益氣滴丸對大鼠主動脈環(huán)三維培養(yǎng)物血管新生與穩(wěn)定的影響（×100）

［1］劉克強(qiáng)，劉彩霞，齊新.芪參益氣浸膏促心肌梗死大鼠心肌血管新生實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2009，1（2）:91.

［2］Zhang L，Wang Y，Yu L，etal.QI-SHEN-YI-QIaccelerates angiogenesisaftermyocardialinfarction in rats［J］.IntJCardiol，2010，143（1）:105-109.

［3］Rhodes JM，Simons M.The extracellularmatrix and blood vessel formation:not justa scaffold［J］.JCellMolMed，2007，11（2）:176-205.

［4］Thyboll J，Kortesmaa J，Cao R，et al.Deletionof thelaminin-4 chain leads to impairedmicrovesselmaturation［J］. MolCell Biol，2002，22（4）:1194-1202.

［5］Aplin C，F(xiàn)ogel E，Zorzi P，et al.The Aortic Ring Modelof Angiogenesis［J］.Methods in Enzymology，2008，443:120-134.

［6］Polverini PJ.Angiogenesis in Health and Disease:Insights into Basic Mechanisms and Therapeutic Opportunities［J］. Journal ofDental Education，2002，66（8）:962-965.

［7］Carmeliet P，Jain RK.Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases［J］. NatRev Drug Discov，2011，10（6）:417-427.

［8］Crawford TN，Alfaro 3rd DV，Kerrison JB，et al.Diabetic retinopathy and angiogenesis［J］.Curr Diabetes Rev，2009，5（1）:8-13.

［9］周鈞，劉克強(qiáng)，齊新，等.芪參益氣浸膏動員內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)大鼠梗死心肌血管新生［J］.山西中醫(yī)，2014，30（6）: 51-54.

［10］向本旭，劉婷婷，孫芳玲，等.VEGF相關(guān)信號通路在血管新生中的研究進(jìn)展［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（12）: 81-86.

［11］Cao RH，Brakenhielm E，Pawliuk R，et al.Angiogenic synergism，vascular stability and improvementof hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2［J］. Nature Medicine，2003，9（5）:604-613.

［12］Bogdanovie E，Nguye VP，DumontDJ，etal.Activation of Tie2 by angiopoietin-1 and angiopoietin-2 results in their release and receptor internalization［J］.JCell Sdi，2006，119: 3551-3360.

［13］Mohan JS，Lip PL，Blann AD，etal.The angiopoietin/Tie-2 systeminproliferativesickleretinopathy:relationto vascularendothelialgrowth factor，itssoluble receptor Flt-1 and von Willebrand factor，and to the effects of laser treatment［J］.BMJ，2005，89:815-819.

Effectsof Qishen Yiqipill on angiogenesisof cu ltured rataortic ring

ZHANGMi-xia，QINXiu-ping，ZHAUNGPeng-wei，ZHANGYan-jun
（Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate theeffectofQishenyiqipillon theangiogenesisof cultured rataortic ring.［Methods］Three dimensional culture of rat aortic rings in 48 wells plate，divided them into four groups:normal group（culturewith normalmedium），VEGFgroup（culturewith normalmedium with 10 ng/ml VEGF），Qishenyiqipill group（culturewith normalmedium with 25μg/mLQiShenYiQipills），and Qishenyiqipillwith VEGFgroup（culture with normalmedium with 25mg/LQishenyiqipills and 10μg/L VEGF）.Every group had three wells.Change the medium every three days.Record the numberof the totalnumber，total length，average length，the longest length of the microvessels which grow out of the aortic ring every two days from the 3rd day after culture until the neovascularization degradation.［Results］In the normalgroup，microvessels gradually grow out from the aortic ring in 1～3 days，and continuegrow longerand longer in the3～7 days，but the numberofneovascularewas the samewith day 3.Then number and length of the neovasculare decreased after 7 days，in the other word，the neovasculare gradually degraded.Comparedwith thenormalgroup，the treatmentgroup can promoteangiogenesisgermination（1～3 days）and growth in 3～7 days.But after 7 days，although the total number（exceptQishen Yiqipill group 13～15 days），total length and average length and the longest length of the new microvascularwas increased than thatof the normal group，but the new vascular rapidly degraded in the Qishen Yiqipill group，in the VEGFgroup the number and length of the neovasculare was not obviously increased and the structure of new vessels in the day 11 was destroyed and degenerated and gradually，in the Qishen Yiqi combined the VEGFgroup the length of neovasculare was increased continully in 7～13 days，indicated that the angiogenesis in this group was increased in 7～13 days sustained.［Conclusion］Qishen Yiqipills can promote angiogenesisof the three-dimensional culture of aortic ring angiogenesis，but thisaffectionmaintained fora short time，if combined with VEGF itcan promote angiogenesis and maintain sustained growth fora long time，and delay the degradation ofangiogenesis.

Astragalusand ginseng；the dropping pill；aortic ring；angiogenesisand stability

R285.6

A

1673-9043（2016）04-0248-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.04.08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202943）。

張密霞（1975-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幮哪X血管藥理。

張艷軍，E-mail:zyjsunye@163.com。

2016-04-27）