柑橘皮渣液態(tài)發(fā)酵制取曲酸工藝優(yōu)化

王淑培，吳玉財，蘭美香，史昌蓉，張　靜

柑橘皮渣液態(tài)發(fā)酵制取曲酸工藝優(yōu)化

王淑培1，吳玉財1，蘭美香1，史昌蓉2，張靜1

（1.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300；2.廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004）

以柑橘皮渣為原料，接種米曲霉，以液態(tài)搖瓶發(fā)酵的形式進行曲酸生產(chǎn)的研究。采用Box-Behnken中心組合設計，通過響應面法優(yōu)化柑橘皮渣發(fā)酵的最佳工藝。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵參數(shù)為米曲霉接種量4%、柑橘皮渣添加量13 g/100 mL、酵母膏添加量1.5 g/100 mL、MgSO4·7H2O添加量0.05 g/100 mL，在此條件下發(fā)酵制得的曲酸質(zhì)量濃度最高，為（11.84±1.44）mg/mL。

柑橘皮渣；米曲霉；曲酸；響應面法

曲酸（kojic acid）是由黃曲霉、米曲霉和寄生曲霉等微生物好氧發(fā)酵所產(chǎn)生的一種弱酸性的次生代謝產(chǎn)物，化學名稱為5-羥基-2-羥甲基-1，4-比喃酮，分子式為C6H6O4，常存在于以食品發(fā)酵行業(yè)中曲霉為菌種的發(fā)酵產(chǎn)品中［1-3］。曲酸具有較強的抗氧化、清除自由基、抑菌、螯合金屬離子、抑制酪氨酸酶活性、增強巨噬細胞的活性等能力，常作為生物防腐劑、護色劑和發(fā)色劑、保鮮劑、護膚美白劑、作物生長促進劑、殺蟲劑、攝影材料護膠乳液、膠片祛斑劑等［4-11］，廣泛應用應用于食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。柑橘皮渣為柑橘加工的主要副產(chǎn)物，其組成為柑橘皮（60%～65%）、殘余果肉（30%～35%）、種子（0～10%），富含果膠、纖維素、木質(zhì)素、香精油色素及多種礦物質(zhì)元素，是一種良好的微生物生長基質(zhì)［12-13］。目前，對柑橘皮渣的資源化利用主要集中在提取精油、色素、果膠等生物活性成分［14-15］，生產(chǎn)乙醇、甲烷等生物燃料［16-17］，堆肥生產(chǎn)有機肥［18］，發(fā)酵生產(chǎn)飼料［19］、制取酶制劑、食品添加劑等方面［20］。隨著柑橘加工業(yè)的逐漸發(fā)展，柑橘皮渣綜合處理問題日益突出。目前主要的處理方式是衛(wèi)生填埋，但在降低柑橘生產(chǎn)效率的同時也會造成二次污染［21］。因此探索柑橘皮渣的利用途徑具有非常重要的現(xiàn)實意義。本試驗以柑橘皮渣為原料，探索發(fā)酵制備曲酸的工藝條件。為柑橘皮渣的綜合利用提供新的途徑，也擴展了曲酸生產(chǎn)的新方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzas）GIM3.423：廣州微生物研究所微生物菌種保藏中心。

柑橘皮渣：柑橘取皮榨汁取渣后置于40℃干燥箱中烘干，粉粹過60目篩密封保存?zhèn)溆谩?/p>

酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑），吐溫-80（化學純），蔗糖、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鐵（均為分析純）：上海展云化工有限公司。

菌種活化和孢子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10g/100 mL、酵母膏0.6 g/100 mL、KH2PO40.5 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、吐溫-80 0.01 g/100 mL、KCl 0.05 g/100 mL、pH 6.0，121℃濕熱滅菌15 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：柑橘皮渣13g/100mL、酵母膏1.5g/100mL、KH2PO40.1 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、KCl 0.05 g/100 mL、pH 6.0。

1.2儀器與設備

UV-3200S紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海慧泰儀器制造有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺上，將裝有米曲霉GIM3.423菌種的安瓿管開啟后，將無菌玻璃棒伸入安瓿管內(nèi)蘸取少量粉末于裝有少量無菌生理鹽水的試管中，微振蕩使粉末分散，在PDA培養(yǎng)皿上斜面劃線培養(yǎng)，置于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，為第一代菌種。第一代菌株用滅菌的生理鹽水沖洗在無菌培養(yǎng)皿上，涂布棒灼燒冷卻后蘸在倒好的PDA平板上涂布，25～28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，為第二代菌種。

1.3.2孢子懸液的制備

用滅好菌的生理鹽水（含有0.01%吐溫-80）將培養(yǎng)好的第二代菌種沖洗下來，制成3×106個/mL的孢子懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3種子培養(yǎng)

按4%的接種量將計數(shù)的孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基（100 mL/250 mL）中，30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)6 h。

1.3.4液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按一定接種量接種于滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)液（100 mL/250 mL）中，在30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)13 d，檢測曲酸的質(zhì)量濃度。

1.3.5優(yōu)化培養(yǎng)基的試驗設計

（1）單因素試驗設計

采用液態(tài)發(fā)酵的方式，選擇柑橘皮渣添加量、接種量、酵母膏添加量、MgSO4·7H2O添加量這4個工藝參數(shù)進行單因素試驗［22］。各因素的水平設置分別為：柑橘皮渣添加量為9 g/100 mL、10 g/100 mL、11 g/100 mL、12 g/100 mL、13 g/100 mL、14 g/100 mL，接種量為2%、4%、6%、8%、10%（V/V），酵母膏添加量為0.9 g/100 mL、1.2 g/100 mL、1.5 g/100 mL、1.8 g/100 mL、2.1 g/100 mL，MgSO4·7H2O添加量為0.025 g/100 mL、0.050 g/100 mL、0.075 g/100 mL、0.100 g/100 mL、0.125 g/100 mL。在不同水平條件下發(fā)酵培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液中曲酸的質(zhì)量濃度。

（2）響應面試驗設計

以發(fā)酵液中曲酸質(zhì)量濃度為考察指標，根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，以接種量（A）、酵母膏添加量（B）、柑橘皮渣量（C）為影響因子，采用Design Expert 8.05b軟件進行設計與分析，通過響應面法優(yōu)化柑橘皮渣液態(tài)發(fā)酵制取曲酸的工藝。響應曲面方案設計的因素與水平見表1。

表1　柑橘皮渣液態(tài)發(fā)酵制取曲酸工藝參數(shù)優(yōu)化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for citrus pomace liquid-state fermentation process optimization for kojic acid production

1.3.6測定方法

曲酸質(zhì)量濃度的測定：采用三氯化鐵比色法［23］。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1柑橘皮渣添加量對曲酸發(fā)酵的影響

圖1　柑橘皮渣添加量對曲酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of citrus pomace contents on kojic acid production

從圖1可以看出，隨著柑橘皮渣添加量的增加發(fā)酵液中曲酸質(zhì)量濃度也隨之增加，在柑橘皮渣添加量為13 g/100 mL時曲酸質(zhì)量濃度最高。原因在于柑橘皮渣量增加，其中的碳源含量增高，有助于米曲霉生長、發(fā)酵，曲酸質(zhì)量濃度隨之增高。但依據(jù)試驗發(fā)酵方式為液態(tài)發(fā)酵，當柑橘皮渣添加量為14 g/100 mL時培養(yǎng)基較為黏稠，培養(yǎng)基接近為半固體。綜合考慮，選擇柑橘皮渣添加量為13 g/100 mL進行后續(xù)試驗。

2.1.2接種量對曲酸發(fā)酵的影響

從圖2可以看出，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中的曲酸質(zhì)量濃度也增高，在接種量為4%時曲酸質(zhì)量濃度達到最高，隨后逐漸降低。因為米曲霉分裂生長在一定空間里是會受到限制的，當分裂到一定程度時便會飽和，此時菌株對菌株相互抑制生長，發(fā)酵受到限制，曲酸質(zhì)量濃度反而緩慢降低。因此選擇接種量為4%進行后續(xù)試驗。

圖2　接種量對曲酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculum on kojic acid production

2.1.3酵母膏添加量對曲酸發(fā)酵的影響

圖3　酵母膏添加量對曲酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of yeast extract concentration on kojic acid production

從圖3可以看出，隨著酵母膏添加量的增加曲酸質(zhì)量濃度變化較為緩慢。在酵母膏添加量為1.5 g/100 mL時曲酸質(zhì)量濃度達到最大值，酵母膏添加量繼續(xù)增高，曲酸質(zhì)量濃度略有下降。因此選擇酵母膏添加量為1.5 g/100 mL進行后續(xù)試驗。

2.2.4 MgSO4·7H2O添加量對曲酸發(fā)酵的影響

圖4　MgSO4·7H2O添加量對曲酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of MgSO4·7H2O concentration on kojic acid production

從圖4可以看出，MgSO4·7H2O添加量對曲酸發(fā)酵的影響非常微小，在MgSO4·7H2O添加量為0.05 g/100 mL時曲酸質(zhì)量濃度最高。因此綜合考慮，選擇MgSO4·7H2O添加量為0.05 g/100 mL進行后續(xù)試驗。

2.3響應面試驗結(jié)果

2.3.1響應面試驗設計及結(jié)果

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以曲酸質(zhì)量濃度（Y）為響應值，以接種量（A）、酵母膏添加量（B）、柑橘皮渣添加量（C）為響應因子，采用Box-Behnken試驗設計3因素3水平的響應面分析試驗，試驗設計及結(jié)果如表2所示。

表2　柑橘皮渣液態(tài)發(fā)酵制取曲酸工藝參數(shù)優(yōu)化響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for citrus pomace liquid-state fermentation process optimization for kojic acid production

利用Design Expert 8.05b分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，可得到二次多項式回歸方程：Y=144.80-3.00A-7.50B+14.50C-3.00AB+11.00AC-14.00BC-9.40A2-36.40B2-28.40C2。對模型進行顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3　回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可知，數(shù)學模型P＜0.000 1，說明該模型顯著；失擬項不顯著（P=0.455 3＞0.05），表明回歸方程具有顯著意義。模型的決定系數(shù)R2=0.944 1，調(diào)整后決定系數(shù)R2Adj為0.986 6，說明方程能解釋98.66%的響應值變化。變異系數(shù)0.41%，說明該數(shù)學模型對試驗擬合較好，試驗誤差小，可以用來預測試驗結(jié)果。二次項A2、B2、C2對響應值曲線效應影響極顯著，交互項AB對響應值曲面效應影響不顯著，交互項AC和BC影響極顯著；3個因素對曲酸得率影響的順序為：C＞B＞A，即柑橘皮渣添加量＞酵母膏添加量＞接種量。

2.3.2響應面分析

各因素的交互作用對曲酸質(zhì)量濃度的影響如圖5所示。

圖5　接種量、酵母膏質(zhì)量濃度、柑橘皮渣質(zhì)量濃度交互作用對曲酸質(zhì)量濃度影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，yeast extract addition，citrus pomace addition on kojic acid production

從圖5可以較為直觀地看出，各因素對發(fā)酵產(chǎn)曲酸質(zhì)量濃度的影響。隨著接種量、酵母膏添加量和柑橘皮渣添加量的增加，曲酸的含量呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，在所選取的數(shù)值內(nèi)均存在極值。沿酵母膏添加量（B）方向比接種量（A）的響應面坡度的坡度更陡，等高線更為密集，說明酵母膏的添加量對曲酸產(chǎn)量的影響大于接種量；等高線呈扁平狀表示兩因素交互影響較大。與方差分析的結(jié)果相一致；柑橘皮渣添加量（C）對曲酸質(zhì)量濃度的影響大于接種量（A），且兩因素的交互作用明顯；柑橘皮渣添加量（C）對曲酸的影響大于酵母膏添加量（B）的影響，兩者交互作用明顯，符合方差分析的結(jié)果。

2.3.3驗證試驗結(jié)果

通過Design Expert 8.05b分析得到模型的極大值點為：接種量3.65%、酵母膏添加量1.45 g/100 mL、柑橘皮渣添加量13.23 g/100 mL，預測得到最高曲酸質(zhì)量濃度為11.31 mg/mL。考慮實際操作性，選取米曲霉的接種量為4%，酵母膏添加量1.5g/100mL，柑橘皮渣添加量13g/100mL進行驗證試驗，平行發(fā)酵5組，測得曲酸的質(zhì)量濃度為（11.84± 1.44）mg/mL。曲酸實際值與預測值吻合度較高，因此響應面優(yōu)化得到的發(fā)酵參數(shù)能夠較為準確地預測實際產(chǎn)曲酸情況。

3　結(jié)論

本研究探索柑橘皮渣液態(tài)搖瓶發(fā)酵制取曲酸的工藝，為柑橘皮渣的綜合利用提供新的途徑。采用單因素試驗和響應面法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。單因素結(jié)果顯示，接種量、酵母膏量、柑橘皮渣量對曲酸質(zhì)量濃度影響較大，且接種量為4%、酵母膏添加量為1.5 g/100 mL、柑橘皮渣添加量為13 g/100 mL，MgSO4·7H2O添加量為0.05 g/100 mL時曲酸質(zhì)量濃度最高。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設計及響應面法分析，進一步優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，得到了各因素對提取量影響的二次回歸模型。方差分析顯示所建模型回歸效果極顯著，擬合度良好。3個因素對曲酸質(zhì)量濃度影響均顯著，且影響順序為柑橘皮渣添加量＞酵母膏添加量＞接種量。優(yōu)化所得最佳工藝參數(shù)為米曲霉的接種量為4%，酵母膏添加量1.5 g/100 mL，柑橘皮渣添加量13 g/100 mL，MgSO4·7H2O添加量為0.05 g/100 mL，在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)曲酸質(zhì)量濃度為（11.84±1.44）mg/mL。

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Optimization of liquid-state fermentation process of kojic acid by citrus pomace

WANG Shupei1，WU Yucai1，LAN Meixiang1，SHI Changrong2，ZHANG Jing1
（1.College of Tea and Food Science，Wuyi University，Wuyishan 354300，China；2.College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

Using citrus pomace as raw material andAspergillus oryzaeas fermentation starter，kojic acid was produced by liquid-state shake flask fermentation.Using Box-Behnken centrol composite design，the optimal fermentation process of citrus pomace was optimized by response surface methodology.As a result，the optimal fermentation parameters were determined as follows：A.oryzaeinoculum 4%，citrus pomace 13 g/100 ml，yeast extract 1.5 g/100 ml，and MgSO4·7H2O 0.05 g/100 ml.Under the conditions，the kojic acid production was the highest of（11.84±1.44）mg/ml.

citrus omace；Aspergillus oryzae；kojic acid；response surface methodology

TS209

0254-5071（2016）07-0108-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.023

2016-03-21

福建省“大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃”項目（201410397041）作者簡介：王淑培（1986-），女，助教，碩士，研究方向為食品科學。