高效液相色譜法測定酵母細胞壁中甘露聚糖和β-葡聚糖

徐婷婷，劉　艷，張子健，周雪玲，陳志穎

高效液相色譜法測定酵母細胞壁中甘露聚糖和β-葡聚糖

徐婷婷，劉艷，張子健，周雪玲，陳志穎*

（唐山拓普生物科技有限公司，河北 唐山 063000）

建立了利用高效液相色譜同時檢測酵母細胞壁中的甘露聚和β-葡聚糖含量的方法。色譜條件為采用Welch Sugar-Ca（7.8 mm× 300 mm）色譜柱，以純水為流動相，流速為0.5 mL/min，柱溫為80℃，示差折光檢測器進行檢測。結果表明，甘露聚糖和β-葡聚糖在200～1 000 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，方法的相對標準偏差＜1.15%，回收率為98%～100%。該方法簡單，準確方便，適用于酵母細胞壁中甘露聚糖和β-葡聚糖含量的檢測。

β-葡聚糖；甘露聚糖；高效液相色譜；酵母細胞壁

酵母甘露聚糖（yeast mannan）和β-葡聚糖（β-glucan）是酵母細胞壁的重要組成成分，二者的總量大約占細胞壁總干質量的85%［1］，其中甘露聚糖位于細胞壁的外層，約占細胞壁干質量的40%～45%［2］，而β-葡聚糖則位于細胞壁的內側，占細胞壁干質量的26%～30%［3］。

酵母β-葡聚糖是一種以β-1，3-D糖苷鍵為主鏈，β-1，6-D糖苷鍵為側鏈的活性多糖［4］。它能夠刺激釋放白介素以增強機體防御有害物質的能力，提高人體免疫力［5-7］。同時具有抗輻射［8］、抗癌［9］、調節血脂、降低膽固醇［10］和促進傷口愈合［6］等功能。酵母甘露聚糖又稱甘露糖蛋白，由兩種糖肽鍵組成，主鏈為單鏈，糖苷鍵以α-1，6形式連接，主鏈上有豐富的支鏈［10］。甘露聚糖具有免疫調節［12］、改善腸道健康［13］、選擇性吸附病原微生物［14］等功能。

酵母β-葡聚糖和甘露聚糖的檢測一般采用不同的方法分開進行檢測，酵母β-葡聚糖檢測多采用苯酚-硫酸法［14-16］和高效液相色譜法［17-19］進行，甘露聚糖的檢測多采用總糖檢測方法和紫外分光光度法［20-22］。但此方法靈敏度較低，不能準確的分辨出甘露聚糖和β-葡聚糖以及其他多糖，檢測結果存在誤差。本研究采用高溫水解-高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定酵母細胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖的含量，確定了最佳水解條件，并采用凝膠多糖（curdlan）和甘露聚糖為對照品，對檢測結果進行校正，為酵母細胞壁中甘露聚糖和β-葡萄糖的含量測定提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酵母細胞壁：唐山拓普生物科技有限公司；鹽酸（體積分數36%～38%）：天津市凱信化學工業有限公司；凝膠多糖（純度≥99.00%）、甘露聚糖（純度≥99.00%）：美國Sigma公司；D（+）-甘露糖（純度≥99.99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2儀器與設備

UltiMate3000高效液相色譜儀：美國戴安公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司；微型漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C酸度計：上?？祪x儀器有限公司；JHH-2數顯恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器制造有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理方法

精密稱取0.400 0 g酵母細胞壁樣品置于50 mL具塞試管中，準確加入一定量的鹽酸，將試管置于漩渦混合器上混合均勻。置于35℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，每隔10 min取出于混合器中混合20 s。然后將混合均勻的樣品轉移到250 mL Schott-瓶中，用純水定容至150 mL，振蕩混勻后置于121℃高壓滅菌鍋中水解60 min。

將水解后的樣品取出，冷卻至室溫，用50%的氫氧化鈉溶液調節pH至6～7。將調好pH值的溶液轉移至200 mL的容量瓶中并定容，用0.45 μm濾膜過濾，高效液相色譜法測定葡聚糖和甘露聚糖含量。

1.3.2標準曲線的繪制

準確稱取0.200 0 g經98～100℃干燥2 h的葡萄糖和甘露糖，用純水溶解并定容至100 mL，搖勻得到質量濃度為2 g/L的葡萄糖和甘露糖標準儲備液，分別吸取1.0 mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL上述溶液于10mL容量瓶中，用純水定容，搖勻得到質量濃度分別為200μg/mL、400μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1 000 μg/mL的葡萄糖和甘露糖混合標準溶液，用0.45 μm濾膜過濾，高效液相色譜法測定標準物質質量濃度與色譜峰面積之間的回歸方程，繪制標準曲線。

1.3.3色譜條件

Sugar-Ca色譜柱：（7.8 mm×300 mm）；流動相：純水（一級水）；流速：0.5 mL/min；柱溫：80℃；進樣量：50 μL。

1.3.4計算公式

式中：X為樣品中葡聚糖或甘露聚糖含量，%；A1為根據樣品溶液的峰面積，在標準曲線上查得的樣品溶液的葡聚糖、甘露聚糖的含量，mg/L；A2為根據甘露聚糖或凝膠多糖的峰面積，在標準曲線上查得的樣品溶液葡聚糖或甘露聚糖含量，mg/L；m1為稱取樣品的質量，g；m2為稱取甘露聚糖對照品或葡聚糖對照品的質量，g；0.2為樣品/甘露聚糖對照品定容后的體積，mL；0.9為將甘露糖換算成甘露聚糖（葡萄糖換算成葡聚糖）的系數；F為樣品酸水解中甘露聚糖或葡聚糖被破壞造成結果偏低的經驗補償系數；P為甘露聚糖或凝膠多糖對照品的純度（依據試劑廠家提供的檢測報告）；W為甘露聚糖或凝膠多糖對照品的水分（依據試劑廠家提供的檢測報告）。

2　結果與分析

2.1標準曲線的建立

使用1.3.2配制的葡萄糖和甘露糖混合標準溶液并采用1.1.3的色譜分析條件進行檢測，各質量濃度的葡萄糖、甘露糖標準溶液對應的色譜峰面積見表1；以標準溶液的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制葡萄糖、甘露糖標準曲線，結果見圖1。

表1　葡萄糖和甘露糖標準溶液HPLC色譜峰面積Table1 HPLC chromatographic peak area of glucose and mannose standard solution

圖1　葡萄糖（A）和甘露糖（B）標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose（A）and mannose（B）

結果表明，在200～1 000 μg/mL范圍內，葡萄糖標準曲線線性回歸方程為：y=0.014 13x-0.014 19，相關系數R2= 0.999 9，甘露糖標準曲線線性回歸方程為：y=0.015 7x+ 0.061 9，相關系數R2=0.999 3。并且在方法設定的色譜條件下，能夠完全將葡萄糖和甘露糖分開，采用同一檢測條件可同時檢測β-葡聚糖和甘露聚糖，排除了甘露聚糖對β-葡聚糖的干擾，檢測色譜圖見圖2、圖3。

圖2　葡萄糖（A）和甘露糖（B）標準品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of glucose（A）and mannose（B）

圖3　葡萄糖、甘露糖標準混合溶液（A）及酵母細胞壁水解液（B）HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of glucose and mannose standard mixed solution（A）and the hydrolysate（B）of yeast cell wall

2.2標準品校準

在確定酸用量、前期處理時間、溫度及水解時間等條件下，酵母細胞壁能夠完全水解為葡萄糖和甘露糖。但在此條件下，強酸可能會對β-葡聚糖和甘露聚糖產生一定的破壞，使其降解為了其他的物質，從而導致檢測結果的偏差［13］。因此，需要采用凝膠多糖和甘露聚糖作為標準品來對水解條件進行校正。

在已確定的水解條件下水解凝膠多糖和甘露聚糖，檢測后計算其含量，通過與理論值進行比較得出一個校正因子F（使用1.3.4中的公式）。在采用本方法水解的條件下，檢測凝膠多糖和甘露聚糖的含量，檢測結果見表2、表3。

表2　凝膠多糖檢測結果Table 2 Detection results of curdlan

表3　甘露聚糖檢測結果Table 3 Detection results of mannan

由表2、表3可知，采用凝膠多糖和甘露聚糖作為標準品測定的校正因子F分別為1.22、1.25。

2.3方法穩定性及回收率

2.3.1穩定性實驗

利用1.3.1中所描述的實驗方法對樣品進行處理及檢測，重復檢測5次，檢測酵母細胞壁中的β-葡聚糖和甘露聚糖含量，結果見表4。

表4　方法穩定性檢測結果Table 4 Detection results of stability of the method

由表4可知，在相同的處理條件下，進行穩定性試驗測試，檢測到的β-葡聚糖和甘露聚糖相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.12%和1.07%，具有良好的穩定性。

2.3.2回收率實驗

準確稱取樣品，加入葡萄糖和甘露糖標準品，按照1.3.1中的處理方法進行樣品處理。將處理好的樣品與標品混合物利用HPLC進行測定，進樣量為50 μL按峰面積計算出平均回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），測定結果見表5。

表5　回收率試驗結果Table 5 Results of recovery rate experiments

由表5可知，此檢測方法中葡聚糖和甘露聚糖的平均回收率分別為98.54%和99.08%，回收率在90%～110%，測定過程中樣品損失程度較低，表示檢測方法準確度高。

3　結論

采用高溫處理-HPLC法同時測定酵母細胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖含量，最佳水解條件為：采用0.55 mol/L的鹽酸水解處理30 min，再121℃高溫高壓處理1 h，調節pH至中性。采用HPLC進行檢測，確定最佳的色譜條件，凝膠多糖和甘露聚糖作為校準品，校正酸水解對β-葡聚糖和甘露聚糖降解的影響，形成最優酵母細胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖含量同時檢測的方法，重復性好、準確性高、簡單易行。

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Determination of mannan and β-glucan in yeast cell wall by HPLC

XU Tingting，LIU Yan，ZHANG Zijian，ZHOU Xueling，CHEN Zhiying*
（Tangshan TOP Bio-Technology Co.，Ltd.，Tangshan 063000，China）

The determination method of mannan and β-glucan content in the yeast cell wall was established by HPLC.The chromatographic conditions were as follows：the chromatographic column Welch Sugar-Ca（7.8 mm×300 mm），mobile phase was pure water，flow rate was 0.5 ml/min，column temperature was 80℃，and the signal was detected by refractive index detector.The results showed that at the range of 20-1 000 μg/ml，the content of mannan and β-glucan had a good linear relationship with the peak area.The relative standard deviation of the method was less than 1.15%. The recovery rate was 98%-100%.The method was simple，accurate and convenient，which was suitable for the determination of mannan and β-glucan contents in yeast cell wall.

β-glucan；mannan；HPLC；yeast cell wall

TS261.1

0254-5071（2016）07-0180-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.039

2016-03-21

徐婷婷（1987-），女，本科，研究方向為生物技術。

陳志穎（1972-），女，高級工程師，博士，研究方向為酵母及酵母衍生物。