納豆激酶NKII分離純化及其酶促動力學研究

李　睿，阮文輝

納豆激酶NKII分離純化及其酶促動力學研究

李睿1，阮文輝2*

（1.山西中醫學院，山西 太原 030024；2.山西省醫藥與生命科學研究院，山西 太原 030006））

該實驗主要采用疏水柱層析分離純化納豆激酶NKII，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果為單一蛋白條帶，分子量為28 ku，酶活回收率56.51%，純化倍數17.90，比活力達48 407.77 IU/mg。采用纖維蛋白平板法及顯色底物法測定酶活力，結果表明，兩種方法相關性高。以S-2251為底物的動力學研究表明，米氏常數Km值為0.379 6 mmol/L，最大反應速度Vm值為0.059 8 mmol/（L·min），Ca2+、Mg2+對酶活穩定性效果明顯。

納豆激酶；分離純化；酶學性質

隨著人們生活節奏的加快、飲食結構的改變等，全球血栓栓塞性疾病的臨床發病率越來越高，心梗、脈管栓塞［1］等均為其引起的常見突發疾病，危害嚴重，發病年齡年輕化，給生活質量帶來極大影響［2］。針對此現狀，近年來溶栓治療和預防類的保健食品及藥物的研發進展迅速［3-5］。納豆激酶（nattokinase，NK）最初源自日本傳統的健康發酵食品—納豆，由納豆枯草芽孢桿菌表達，屬絲氨酸蛋白酶，具有很強的溶栓活性。對其的研究多集中在菌種選育、表達優化、溶栓機理［6］、活性測定方法、純化方法、基因的克隆與表達［7］等方面。NK溶栓途徑有直接降解纖維蛋白、激活尿激酶與組織型纖溶酶原激活劑等，溶栓效果好，易提取、成本低、半衰期長、特異性強、不引起系統性纖溶、食源性安全無毒副作用、易吸收、可口服，具有很好的開發潛力。

本研究對象為篩選所得納豆枯草芽孢桿菌，產酶量大、活性高，具有極高工業應用價值。目前纖溶活性產品存在活性低、單療程所需注射劑量大的缺點［8-10］，并且純化過程復雜，活性檢測方法繁瑣。本研究希望建立純化納豆激酶的便捷方法，并深入探究所得NKII的活性檢測方法和酶促反應動力學參數。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

納豆枯草芽孢桿菌：本實驗室保藏。對硝基苯胺（pnitroaniline，pNA）：中國醫藥上海化學試劑公司；合成發色底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA·2HCl）：意大利Chromogenix公司；牛纖維蛋白原、尿激酶（1240 IU/mL）、凝血酶（150 BP）：中國藥品生物制品檢定所；苯基-瓊脂糖凝膠（PhenylSepharoseCl-4B）：美國AmershamBiosicences公司。

1.2儀器與設備

AKTA prime 100蛋白質快速純化系統：Amersham Biosicences公司；8500型紫外分光光度儀：上海天美科技有限公司；Multiskan Ascent Thermo Labsystems酶標儀：Thermo公司；J2-HC離心機：美國Beckman公司；905-ULTS超低溫冰箱：美國Forma Scientific公司。

1.3方法

1.3.1納豆激酶NKII粗酶液制備

納豆枯草芽孢桿菌經種子培養，30℃、150 r/min振蕩培養18 h；搖瓶發酵30℃、50 r/min振蕩培養72 h，離心取上清液制備NKII粗酶液。

1.3.2分級鹽析

NKII粗酶液中加入硫酸銨至不同飽和度，4℃靜置12 h后離心，分別檢測上清液及沉淀中酶活力。

1.3.3疏水層析

采用Phenyl Sepharose疏水柱層析分離純化NKII。上樣緩沖液為NaCl濃度1.5 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4），階段洗脫NaCl濃度依次為0.9 mol/L、0.3 mol/L、0，洗脫速度2.0 mL/min，檢測并收集吸收峰。

1.3.4 SDS-PAGE電泳［11］

分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%。

1.3.5顯色底物法與纖維蛋白平板法的相關性

配制不同濃度NKII溶液，分別用纖維蛋白平板法、顯色底物法檢測其活性，以纖維蛋白平板法測得結果為橫坐標，顯色底物法檢測得結果為縱坐標作圖，考察其相關性。

1.3.6酶反應速率曲線

酶促反應過程中，每隔1 min檢測一次A405nm，至其基本恒定為止，通過標準曲線計算產物pNA的濃度。以反應時間為橫坐標，產物濃度為縱坐標，繪制速率曲線。

1.3.7 NKII的Km與Vm的測定

37℃條件下，酶作用于不同濃度底物S-2251溶液8 min后，分別測其A405nm，根據標準曲線找到對應產物pNA的濃度C，并換算為反應速率作圖，反應速率［mmol/（L·min）］= pNA濃度C（mmol/L）/反應時間8（min）。

以底物S-2251濃度為橫坐標，酶反應速率V作為縱坐標，作圖繪制米氏曲線。據Lineweaver-Burk雙倒數法作圖［14］，根據改寫的米氏方程：由直線的斜率和截距，計算出該溫度下的表觀動力學參數Vm和Km值。

1.3.8測定方法

蛋白質含量的測定：考馬斯亮藍法，以牛血清白蛋白為標準品［12］。繪制蛋白標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白質含量。

酶活力測定：纖維蛋白平板法參照ASTRUP T等［13］的方法，以纖維蛋白溶解圈面積表示NKII活性。取10 μL溶液點樣于纖維蛋白平板，37℃、18 h后測溶圈面積，以尿激酶為標準品，以尿激酶標準品的溶圈面積對應酶活為1 IU/mL。繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中NKII活性。

顯色底物檢測法：取50 μL S-2251底物溶液，37℃預熱5 min，加入預熱2 min的酶液50 μL迅速振蕩，37℃、8 min后，酶標儀檢測其光吸收值A405nm。pNA標準曲線回歸方程為Y=3.901 1X-0.000 3，相關系數0.999 1。

在37℃、pH值7.4的條件下，每分鐘催化水解產生1 μmol的pNA的酶活力定義為1U。其計算公式為：

酶活U（μmol·min-1·L-1）=

2　結果與分析

2.1尿激酶標準曲線

尿激酶標準曲線見圖1。

由圖1可知，當酶濃度為0～200.0 IU/mL時，酶活力單位與溶圈面積線性關系良好，相關系數為0.994 7。

2.2分級鹽析

圖2　NKII分級鹽析曲線Fig.2 Salt-outing curve of NKII

由圖2可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，NKII在上清液中逐步減少，沉淀中逐漸增加。30%飽和度之前，90%以上的酶活都在上清中，超過70%飽和度時，90%的酶活都集中在沉淀。故采用30%飽和度硫酸銨沉淀除去雜蛋白，再用70%飽和度硫酸銨沉淀NKII。

2.3 Phenyl Sepharose疏水柱層析

圖3　疏水層析洗脫曲線Fig.3 Elution curve of hydrophobic chromatography

圖4　洗脫峰纖維蛋白平板溶圈Fig.4 Dissolved area of eluting peak

由圖3、圖4可知，層析過程中有3個洗脫峰，僅第1洗脫峰（1～4管）收集液，可以明顯檢測到酶活，其余峰收集液均未測得酶活。蛋白檢測表明第1洗脫峰蛋白含量最高。

2.4 SDS-PAGE電泳純度鑒定

圖5　SDS-PAGE測定NKII分子質量Fig.5 Molecular mass of NKII by SDS-PAGE

由圖5可知，疏水層析后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電脈（sodiumdodecylsulfate-polypropyleneamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，結果為單一蛋白譜帶，表明分離所得NKII達到電泳純。對比標準蛋白NKII的分子質量為28 ku。

2.5 NKII純化方案評價

表1　各步純化結果Table 1 Results of different purification steps

由表1可知，通過硫酸銨分級鹽析和Phenyl Sepharose疏水柱層析后的樣品，酶活回收率56.51%，純化倍數17.90，比活力達48 407.77 IU/mg。該方案具有純化步驟簡單、纖溶活性高的明顯優勢。

2.6顯色底物法與纖維蛋白平板法的相關性

纖維蛋白平板法能直觀地測得纖溶活性，但受時間、溫度、平板制作及點樣技術等實際操作影響較大；且該法不能定量檢測產物的生成，無法進行反應動力學研究。顯色底物法能彌補平板法的缺陷，靈敏、方便、準確。NKII能水解連有pNA顯色基團的小肽底物S-2251，可以進行動力學研究。

圖6　顯色底物法與纖維蛋白平板法測定酶活相關性Fig.6 Enzyme activity correlation determination of fibrin plate and chromogenic substrate method

由圖6可知，兩種方法間相關性方程為：Y（顯色底物法）=0.0390X（纖維蛋白平板法）+0.6428，相關系數0.9901，具有較高相關性，因此可認為顯色底物法檢測得的NKII活性可以表示其纖溶活性。

2.7 NKII反應速率曲線

酶反應速率V僅在最初一段時間內保持恒定，隨反應時間延長，V逐漸下降，原因有底物濃度降低，產物對酶的抑制、產物濃度增加加速了逆反應等。研究酶反應速率應以酶反應初速率V0為準，此時各種干擾因素尚未起作用，速率保持恒定不變化［14］。

圖7　NKII酶反應速率曲線Fig.7 Curve of NKII reaction velocity

由圖7可知，反應進行的前8 min之內，產物pNA濃度與時間成正比增加，斜率恒定；之后pNA隨時間的增加變緩，30 min后，pNA濃度幾乎不再增加。因此測反應初速率V0的最佳時間確定為8 min。

2.8 NKII的Km與Vm的測定

米氏曲線即反應初速率V0與初始底物濃度［S］之間的關系。［S］對V0的影響較復雜，由圖8可知，［S］較低時，V0與［S］成正比，隨著［S］增加，V0不再成正比升高，表現為混合級；繼續增大［S］，V0幾乎保持不變，此時反應體系中的酶被底物飽和［14］。

圖8　底物濃度對NKII反應速率的影響Fig.8 Effect of substance concentration on reaction velocity of NKII

圖9　米氏常數雙倒數曲線Fig.9 Lineweaver-Burk cruve of Km

如圖9所示，1/［S］與1/V二者基本呈直線關系，方程為y=6.304 8x+16.721 5，相關系數R為0.997 6，符合米氏方程，據直線的斜率和截距計算出該溫度下的表觀動力學參數米氏常數Km為0.379 6 mmol/L，最大反應速率Vm為0.0598mmol/（L·min）。

2.9金屬離子對NKII穩定性的影響

常見金屬離子對NKII酶活力的影響如表2所示。

表2　金屬離子對NKII酶活性的影響Table 2 Effect of metallic ion on the enzyme activity of NKII

由表2可知，Ca2+、Mg2+對活性的穩定性效果明顯，是較好的激活劑；Na+、K+無明顯影響；Zn2+、Co2+、Fe2+抑制作用較小，Mn2+、Cu2+有明顯抑制作用；Hg2+作為重金屬，對蛋白質有變性作用，使NKII活性完全喪失。

3　結論

本研究以高產納豆枯草芽孢桿菌發酵液為原料，離心除菌體，硫酸銨分級鹽析，并僅通過一步Phenyl Sepharose疏水柱層析實現了NKII的分離純化［15-16］。酶收率56.51%，純化倍數17.90，比活力高達48 407.77 IU/mg；證實了顯色底物法與纖維蛋白平板法之間具有高相關性；動力學研究表明其米氏常數Km為0.379 6 mmol/L，最大反應速率Vm為0.0598mmol/（L·min）。

［1］HAMMES M，DESAI A，PASUPNETI S，et al.Central venous catheters：incidence and predictive factors of venous thrombosis［J］.Clin Nephrol，2015，84（7）：22-28.

［2］MARNEJON T，ANGELO D，ABU ABDOU A，et al.Risk factors for upper extremity venous thrombosis associated with peripherally inserted central venous catheters［J］.J Vasc Access，2012，13（2）：232-238.

［3］JIN M，CHEN W，HUANG W，et al.Preparation of pegylated lumbrokinase and an evaluation of its thrombolytic activity bothin vitroandin vivo［J］.Acta Pharmaceutica Sinica B，2013，3（2）：123-129.

［4］MIYAZAKI H，SAI H，OHMIZU H，et al.Synthesis and evaluation of 1，4-diphenylbutadiene derivatives as inhibitors of plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）production［J］.Bioorg Med Chem，2010，18（5）：1968-1979.

［5］MIYAZAKIH，MIYAKET，TERAKAWAY，etal.Evaluationofpyrrolin-2-one derivatives synthesized by a new practical method as inhibitors of plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）［J］.Bioorg Med Chem Lett，2010，20（2）：546-548.

［6］UNREAN P，NGUYEN N H.Metabolic pathway analysis and kinetic studies for production of nattokinase inBacillus subtilis［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2013，36（1）：45-56.

［7］劉靚蕾，張妍，孫曉蕾，等.人工合成的納豆激酶基因轉化煙草的研究［J］.生物技術通報，2014（10）：94-99.

［8］DAHIYA M，SINGH S，RAJAMOHAN G，et al.Intermolecular interactions in staphylokinase-plasmin（ogen）bimolecular complex：function of His43 and Tyr44［J］.FEBS Lett，2011，585（12）：1814-1820.

［9］EL-AYACHE N C，LI S H，WARNOCK M，et al.Novel bis-arylsulfonamides and aryl sulfonimides as inactivators of plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）［J］.Bioorg Med Chem Lett，2010，20（3）：966-970.

［10］GAMBLEJ，KENNYS，DOCKRAYGJ.Plasminogenactivatorinhibitor（PAI）-1 suppresses inhibition of gastric emptying by cholecystokinin（CCK）inmice［J］.Regul Pept，2013，185（1）：9-13.

［11］郭堯軍.蛋白質電泳實驗技術［M］.北京：科學出版社，2001：123-157.

［12］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.北京：高等教育出版社，1997：138-140.

［13］ASTRUP T，MULLERFZ S.The fibrinplate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biopys，1995，40：346-351.

［14］王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學上冊［M］.北京：高等教育出版社，2002：351-362

［15］郭希娟，張桂芳，劉遠洋.層析法分離純化納豆激酶的技術參數研究［J］.中國釀造，2011，30（10）：55-57.

［16］魏嶸，張桂芳，劉遠洋.兩種粗提純法對纖溶酶純化效果的比較研究［J］.中國釀造，2012，31（1）：184-187.

Separation，purification and enzymatic kinetics of nattokinase NKII

LI Rui1，RUAN Wenhui2*
（1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China；2.Shanxi Institute of Medicine and Life Science，Taiyuan 030006，China）

The nattokinase NKII was separated and purified by hydrophobic chromatography.The purified enzyme showed a single protein band in the SDS-PAGE and the molecular weight was 28 ku.The enzyme overall yield was 56.51%，the purification factor was 17.90 and the specific activity of NKII was 48 407.77 IU/mg.The activity of NK was detected by the methods of fibrin plate and chromogenic substrate method.Results proved that two methods had high correlation.When S-2251 was used as substance，the kinetic parameter Kmwas 0.379 6 mmol/L and Vmwas 0.059 8 mmol/（L·min），Ca2+and Mg2+showed significant effect on enzyme activity stability.

nattokinase；separation and purification；enzyme characteristic

Q819

0254-5071（2016）07-0089-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.019

2015-02-20

山西省科技攻關項目（20110321081-01，20120313016）；山西省經信委基金項目（晉財2010-010））

李睿（1979-），女，講師，碩士，研究方向為生物化工、食品、保健品與藥品研發。

阮文輝（1979-），男，工程師，博士，研究方向為生物化工、食品、保健品與藥品研發。