不同發酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響

李世燕，朱　丹，牛廣財，任躍英，魏文毅，王　贏

不同發酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響

李世燕1，朱丹2，3*，牛廣財1，任躍英2，魏文毅1，王贏1

毛酸漿（Physalis pubescensL.）別名洋菇娘、黃菇娘等，為茄科酸漿屬多年生草本植物。其大多數分布在美洲熱帶及溫帶地區，少數分布在歐亞大陸及東南亞，在我國主要產地為內蒙古呼倫貝爾盟和黑龍江省［1］。毛酸漿是一種藥食兩用植物，具有解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預防動脈硬化和心血管疾病的發生以及保護皮膚等作用［2-4］，深受大眾的喜愛。

酵素中含有豐富的維生素、酶、礦物質和次生代謝產物等營養成分，是一種功能性微生物發酵產品，它具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能［5］。近年來，國內外對酵素制備及其抗氧化的關注程度逐漸提高［6］，蔣增良等［7］對藍莓酵素、葡萄酵素［8］在天然發酵過程中的抗氧化性能進行研究，發現藍莓酵素具有高抗氧化性能；賈麗麗等［9］對冬棗酵素發酵過程中生物學特性和抗氧化活性進行了研究，發現還原力、羥自由基清除率和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力均不斷升高；董銀卯等［10］也發現火龍果酵素有很強的生物活性；KRIS-ETHERTON P M等［11］研究表明富含抗氧化成分的食品在防治自由基引起的疾病方面有重要的作用。

但是，目前尚少見到有關毛酸漿酵素制備與抗氧化性方面的報道。本研究以毛酸漿果為主要原料，采用不同發酵工藝制備毛酸漿酵素，以還原力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和SOD酶活性為評價指標，對比分析不同發酵制備工藝的毛酸漿酵素的抗氧化性，以期選出一種較優的發酵工藝并對其保健功能提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

毛酸漿：黑龍江省大慶市農貿市場；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.557：中科院微生物研究所；蔗糖（白砂糖）：黑龍江北方糖業股份有限公司；SOD酶活力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；Tris、鹽酸：天津市瑞金特化學品有限公司；甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：天津市大茂化學試劑廠；鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸：國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

HR7633型打漿機：珠海經濟特區飛利浦家庭電器有限公司；DRP-9052型電熱恒溫培養箱、SPH-250型生化培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；Exploter分析天平：奧豪斯儀器上海有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；WS113手持糖度儀：上海測維光電技術有限責任公司；BCN-1360型超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器有限公司；湘儀L420臺式低速自動平衡離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1發酵方式

（1）菌種的活化

酵母菌活化：將安琪牌葡萄酒用高活性干酵母用10倍水在30～32℃水浴鍋中活化30 min備用。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.557活化：將試管斜面保存的植物乳桿菌1.557接種于100 mL的MRS肉湯培養基中，在37℃條件下培養48 h，備用。

（2）發酵方式

操作要點：

（1）毛酸漿前處理：選取成熟度好、粒大飽滿、無病蟲害、無霉變的毛酸漿鮮果，去除萼片，清水洗滌后熱燙30 s，冷卻瀝干后將其破碎，得到毛酸漿原漿。

（2）接菌發酵：將毛酸漿原漿與白砂糖按質量比1∶1加入到已滅菌的1 000 mL廣口玻璃瓶中，在無菌操作臺上接菌發酵。

（3）發酵方式：①自然發酵：在室溫條件下，自然發酵22 d。②先接種酵母菌后接種植物乳桿菌1.557順序發酵：先接入0.2%活化好的酵母菌在30℃條件下發酵10 d，再接入1%活化好的植物乳桿菌1.557在37℃條件下繼續發酵12 d。③先接種植物乳桿菌1.557后接種酵母菌順序發酵：先接入1%活化好的植物乳桿菌1.557在37℃條件下發酵10 d，再接入0.2%活化酵母菌繼續發酵12 d。④酵母菌-植物乳桿菌1.557同時接種發酵：同時接入0.2%已活化好的酵母菌和1%已活化好的植物乳桿菌1.557發酵22 d。

（4）指標測定：在發酵過程中，定期取樣，樣品經3 600 r/min離心15 min后，取上清液用于測定發酵液的各項指標。

1.3.2毛酸漿酵素還原力的測定

取0.2 mL發酵液，加入2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.6），加入1 mL 10%鐵氰化鉀溶液，于50 mL水浴中20 min，快速冷卻后，加入2.5 mL 20%三氯乙酸溶液，3 600 r/min離心15 min，立即取2.5 mL上清液加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵。以去離子水為參比，在波長700 nm處測定吸光度值［12］。以吸光度值A700nm反映毛酸漿酵素還原能力，吸光度值越大，說明還原能力越強，抗氧化性越好。

1.3.3毛酸漿酵素DPPH自由基的清除作用

取40 μL發酵液加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液中，再加入450μL50mmo/LTris-HCl緩沖液（pH=7.4）。25℃條件下恒溫水浴30 min，以去離子水為參比溶液。在波長517 nm條件下測定吸光度值［12］。DPPH自由基清除能力計算公式如下：

式中：A0為空白對照液吸光度值；A1為樣品測定管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.4毛酸漿酵素SOD酶活性的測定

發酵過程中，每隔6 d取50 mL發酵液離心取上清液，按照SOD試劑盒說明書測定酶活性［9］。

2　結果與分析

2.1毛酸漿酵素制備過程中還原力的變化

還原能力是指物質提供電子的能力，還原能力強的物質能給自由基供應電子，使其成為較穩定的物質，從而中斷自由基的連鎖反應［13］。本試驗采用鐵氰化鉀法測定不同發酵工藝的毛酸漿酵素的還原能力，以顯色反應吸光度值的高低反映物質還原能力的強弱，結果見圖1。

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，自然發酵和發酵方式3的還原力都呈先上升后下降的趨勢，還原力分別在發酵第13天時達到最大值0.738和1.051。發酵方式1和發酵方式2分別出現了兩次快速上升階段，分別是酵母菌快速增值階段和乳酸菌快速增值階段，且酵母菌發酵階段的上升幅度較乳酸菌發酵階段更大。發酵22 d后，各發酵方式的還原力趨于穩定，不同發酵方式的毛酸漿酵素的還原能力大小排序為：發酵方式3＞發酵方式1＞發酵方式2＞自然發酵，并且發酵方式1、發酵方式2和發酵方式3的還原力比自然發酵分別提高了30.74%、27.27%和39.83%，經SPASS軟件分析差異顯著（P＜0.05）。說明經過酵母菌和植物乳桿菌1.557發酵，毛酸漿酵素的抗氧化成分在不斷增加，抗氧化活力得到了很大地提高。這可能是酵母菌和植物乳桿菌1.557產生SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH）等抗氧化酶類清除活性氧所致［14-15］。

圖1　發酵過程中還原力變化Fig.1 Changes of reducing power during fermentation process

2.2毛酸漿酵素DPPH自由基清除能力的變化

DPPH法是評價抗氧化能力的常用方法之一，其基本原理為：DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基，呈現深紫色，其孤對電子在波長517 nm附近有強吸收。當有自由基清除劑存在時，自由基清除劑與孤對電子配對，使得其吸收消失或減弱，溶液顏色變淺。因此，可以通過吸收減弱的程度，來評價自由基清除劑的活性［16］。由于此法簡單方便，而且DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更穩定，這使得DPPH自由基已被廣泛用于分析抗氧化活性成分的自由基清除能力［17］。

不同發酵方式的毛酸漿酵素在發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化結果見圖2。由圖2可知，發酵22 d后，不同發酵方式制備的毛酸漿酵素和對照的DPPH自由基清除能力均上升，自然發酵和發酵方式1、2和3的DPPH清除率比第1天分別上升了18.97%、22.12%、21.30%和23.02%，經SPSS軟件分析差異顯著（P＜0.05）。發酵22 d后發酵方式1、2和3與自然發酵相比分別提高了22.94%、15.49%和26.74%，發酵方式3在第7天時DPPH自由基清除能力達到最大值30.97%，此結果比毛酸漿原液的DPPH自由基青的清除能力高42.01%。在整個發酵過程中，發酵方式1和發酵方式2也出現了兩次快速上升階段，這與還原力的變化趨勢是一致的。造成這種差別的原因可能是由于酵母發酵階段酚類和黃酮類物質被浸提出來，含量均逐漸增加，從而使得酵母發酵階段的DPPH自由基清除能力逐漸增大。SHAHIDI F等［18］研究也認為酚類物質能很容易的給出一個氫離子并通過共振雜化而穩定，是具有高自由基清除能力的主要原因。另外，也可能是多酚和酵素內其他抗氧化物質共同作用的結果。

圖2　發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.2 Changes of DPPH free radical scavenging ability during fermentation process

2.3毛酸漿酵素制備過程中SOD酶活性的變化

超氧化物歧化酶（SOD）是一種廣泛存在于動、植物及微生物中的金屬酶，是國內外公認的氧自由基的專一清除劑，與機體衰老、腫瘤發生、自身免疫性疾病和輻射防護等有關。目前，SOD活性已成為抗衰老藥物和抗衰老保健食品的一個重要指標［19］。不同發酵方式制備的毛酸漿酵素在發酵過程中SOD酶活力的變化見圖3。由圖3可知，隨著發酵時間的延長，各發酵方式中SOD酶活力呈上升趨勢，發酵22 d后，自然發酵和發酵方式1、2和3的SOD酶活力分別上升至216.18、399.41、364.01和409.52 U/mL，經SPSS分析差異顯著（P＜0.05），四種發酵方式相比于毛酸漿原漿的SOD酶活力分別提高了23.27%、49.83%、44.95%、52.06%；發酵方式1、2和3比自然發酵分別提高了52.93%、39.37%和56.80%。這說明酵母菌和植物乳桿菌1.557均能夠產生超氧化物歧化酶，提高毛酸漿酵素的抗氧化活性。

圖3　發酵過程中SOD酶活力的變化Fig.3 Changes of SOD activities during fermentation process

2.4討論

近年來，酵素制品風靡世界，在營養保健、臨床醫學、養生等領域的利用已經非常廣泛。然而，目前酵素的制作主要以自然發酵為主，發酵過程復雜且周期較長，工業上無法批量生產。其次，目前酵素產品的生產大多是日本或臺灣專利，在國內售價很高，因此需要積極開發有自主知識產權的工藝技術，以減低生產成本。

目前，酵素的發酵菌種主要有酵母菌和乳酸菌，本研究用酵母菌和植物乳桿菌1.557進行多菌種發酵，通過調整發酵順序實現毛酸漿酵素的多工藝發酵，進而選出較優的發酵工藝。研究發現，發酵方式3的還原力在第13天時達最大值1.051，優于藍莓酵素（第48天，0.538）［7］、葡萄酵素（第56天，0.367）［8］以及7%的核桃青皮果蔬酵素（第180天，0.766）［20］的還原力，這可能是由于毛酸漿經酵母菌和植物乳桿菌1.557發酵產生大量的SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和還原型輔酶等抗氧化酶類，不斷清除活性氧，并且毛酸漿酵素中的抗氧化成分在不斷增加，使其抗氧化活力得到了很大提高；DPPH自由基清除能力在第7天時達最大值30.97%，低于藍莓酵素（第48天，94.41%）［7］、葡萄酵素（第56天，91.32%）［8］以及7%火龍果酵素（96.5%）［10］的DPPH自由基清除能力。這是由于藍莓和葡萄中含有大量的酚類物質，而火龍果中含有花青素物質，它們都具有很強的抗氧化性，從而提高清除DPPH自由基的能力，因而高于毛酸漿酵素的DPPH自由基清除能力；但是毛酸漿酵素發酵第22天時的SOD酶活性最高達409.52 U/mL，高于15%的火龍果酵素的SOD酶活性（300 U/mL）［10］，說明毛酸漿酵素發酵液有很好的自由基清除能力。

3　結論

研究結果表明，毛酸漿酵素發酵22 d后，與自然發酵相比，3種發酵工藝的還原力分別提高了30.74%、27.27%和39.83%；DPPH自由基清除能力分別升高了22.94%、15.49%和26.74%；SOD酶活力分別升高了52.93%、39.37%和56.80%。即在整個發酵過程中，3個人工接種工藝的毛酸漿酵素的抗氧化性均高于自然發酵，這說明人工接種微生物發酵可以提高酵素內的抗氧化成分，提高其抗氧化性。實驗還表明，同時接種酵母菌和植物乳桿菌1.557的毛酸漿酵素抗氧化性最好，還原力在第10天時達最大值1.051，DPPH自由基清除能力在第7天時達最大值30.97%，發酵第22天時毛酸漿酵素的SOD酶活性最高達409.52 U/mL。

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（1.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；3.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

以毛酸漿為主要原料，采用自然發酵、酵母菌-植物乳桿菌先后順序接種發酵、酵母菌-植物乳桿菌同時接種發酵等不同發酵工藝制備毛酸漿酵素，并對其發酵過程中的還原力、DPPH自由基清除能力和超氧化物歧化酶（SOD）活性進行研究，初步評價不同發酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響。結果表明，不同發酵工藝制得毛酸漿酵素均有較強的抗氧化性，發酵第22天，與自然發酵相比，3種人工接種發酵制備工藝的毛酸漿酵素的還原力分別提高了30.74%、27.27%和39.83%；DPPH自由基清除能力分別提高了22.94%、15.49%和26.74%；SOD酶活性分別提高了52.93%、39.37%和56.80%。其中，酵母菌和乳酸菌同時接種發酵的毛酸漿酵素產品抗氧化性最好，還原力最高達1.051，DPPH自由基清除能力最高達30.97%，SOD酶活性最高達409.52 U/mL。

毛酸漿；酵素；發酵工藝；抗氧化性

Effect of different fermentation technologies on antioxidant activity ofPhysalis pubescensenzyme

LI Shiyan1，ZHU Dan2，3*，NIU Guangcai1，REN Yueying2，WEI Wenyi1，WANG Ying1
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Physalis pubescensenzyme was prepared by different fermentation technologies（including natural fermentation，yeast-Lactobacillus plantaruminoculated fermentation in order，yeast-Lactobacillus plantaruminoculated fermentation at one time），the reducing power，scavenging capacity to DPPH radical and SOD activity were detected during fermentation，and the effect of different fermentation technologies on the antioxidant activities ofP.pubescensenzyme was studied.The results showed that theP.pubescensenzyme that got from different fermentation technologies had strong antioxidant activity.Compared with the natural fermentation after 22 d，the reducing power of artificial inoculation fermentation improved by 30.74%，27.27%and 39.83%，respectively，the scavenging capacity to DPPH improved by 22.94%，15.49%and 26.74%，respectively.Furthermore，the SOD activity improved by 52.93%，39.37%and 56.80%，respectively.The enzyme of yeast-L.plantaruminoculated fermentation at one time had the optimal antioxidant activity，the reducing power was up to 1.051，the scavenging capacity to DPPH was up to 30.97%and the SOD activity was up to 409.52 U/ml.

Physalis pubescens；enzyme；fermentation technology；antioxidant activity

TS201.2

0254-5071（2016）07-0085-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.018

2016-05-22

黑龍江八一農墾大學研究生創新科研項目（YJSCX2015-Y49）

李世燕（1989-），女，碩士研究生，研究方向為園產品加工。

朱丹（1972-），女，副教授，博士研究生，研究方向為藥用植物。