武漢酒曲中可培養霉菌的分離鑒定及酒釀營養成分分析

陳　璐，姚淑敏，閆華文

武漢酒曲中可培養霉菌的分離鑒定及酒釀營養成分分析

陳璐，姚淑敏*，閆華文

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

從酒曲中分離純化可培養霉菌，對其進行18S rDNA分子鑒定并測定發酵產物甜酒釀的總糖、酒精度、總酸、氨基酸態氮含量。結果表明，從酒曲中分離得到5株霉菌分別命名為FJ-M-1、FJ-M-2、FJ-M-3、FJ-M-4、FJ-M-5，經鑒定，FJ-M-1和FJ-M-5與印度毛霉JN974020相似度達到98%，FJ-M-2與單卷毛霉KF805740相似度達到99%，FJ-M-3與單卷毛霉KF805739相似度達到99%，菌株FJ-M-4與Pilaira anomala菌株相似度為99%。對發酵產物甜酒釀營養成分分析得到，總糖含量先升高，后降低，發酵60 h時達到最高值，為246 g/L；總酸含量呈逐漸升高的趨勢，發酵84 h時達到最高值為7.6 g/L；氨基酸態氮的含量先升高，然后趨于穩定，84 h時甜酒釀中達到最高為0.3 g/L；酒精度逐漸升高，48 h后趨于穩定，酒精度達到8.0%vol。

酒曲；甜酒釀；18S rDNA；霉菌；營養成分

甜酒釀又稱江米酒、酪糟、米酒、伏汁酒、糯米酒、甜米酒、酒釀兒等，是一種富含脂肪酸、低聚糖、微量元素及乳酸菌、酵母菌的低酒精度飲品。其所含的低糖成分極易被人體吸收，具有快速補充能量、健胃健脾的功效；適量的有機酸和各種維生素、礦物質亦能被人體快速吸收利用，達到均衡營養保健的作用［1-4］。

霉菌作為一種在各種酒曲中都存在的功能菌，是我國酒曲微生物的重要組成部分，具有糖化力強、能產生多種影響酒類風味的物質，在酒的發酵過程中發揮著不可替代的作用。常用于釀酒的霉菌主要包括根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）、犁頭霉屬（Absidia）、青霉屬（Penicillium）等［5-9］。

于博等［10］對廣東肇慶傳統小曲的優勢霉菌進行了分離，得到糖化酶活力強的菌株F6，經鑒定為米根霉；周光來等［11］從恩施酒曲中也分離得到了具有較高的糖化酶和液化酶活性的根霉菌株；喻鳳香等［12］從酒曲中分離到30株根霉菌，其中RhizopusRN-1、RhizopusRA-1、RhizopusRS-1、RhizopusRQ-1能產生低聚糖酶，其糖化酶和液化酶活力比菌株Q303高；姚淑敏等［13］從湖南、福建酒曲中分別分離到5株霉菌，主要是根霉。

DUNG N T P等［14］從米酒中分離鑒定出5株酵母菌和魯氏毛霉（Amylomyces rouxii）、少孢根霉（Rhizopus oligosporus）、米根霉（Rhizopus oryzae）等霉菌。YANG S等［15］對韓國的39種Nuruk樣品進行研究，從中分離得到174株絲狀真菌。由此可見，霉菌在酒釀的發酵過程中起到重要的作用。

近年來，除了對甜酒曲中微生物進行研究，大批的國內學者致力于研究甜酒釀發酵工藝的優化以及甜酒釀中營養成分的分析，對其中含有的營養成分進行定性和定量分析，為進一步提高和優化甜酒釀的品質提供了參考。楊勇等［16］使用3株米根霉菌株發酵甜酒釀，通過測定發現灰分含量為0.44～0.46g/100mL，粗蛋白為1.50～1.60g/100mL，粗脂肪含量和酸度均為0.34～0.46 g/100 mL，而還原糖含量為35.76～37.34 g/100 mL，酒精度為2.1%vol，并重點研究了氨基酸種類及含量，19種氨基酸總含量達到（1 100～1 700 mg/100 mL，其中谷氨酸含量最高，必需氨基酸的比例達到32.00%～35.45%。田亞紅等［17］以市售的安琪甜酒曲為發酵劑制作甜酒釀，分別對糖化酶的活力、還原糖、乙酸和乙醇在發酵過程中的變化規律進行了研究。

本研究通過分離純化技術得到酒釀中的霉菌，利用18SrDNA進行分子鑒定，目的是了解武漢酒曲中霉菌的多樣性。進一步對發酵酒釀的營養成分進行定量分析，了解其營養元素、發酵特點和風味，對甜酒釀品質的進一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

武漢酒曲：市售。

沙氏液體培養基：蛋白胨10 g/L、葡萄糖40 g/L，pH=5.6±0.2；沙氏固體培養基：在沙氏液體培養基中加入瓊脂20 g/L。

費林甲液：稱取60.28 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）用蒸餾水溶解后，移入1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻過濾即成。

費林乙液：稱取346 g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于約500 mL蒸餾水中；另稱取氫氧化鈉（NaOH）100 g溶于約200 mL蒸餾水中。將兩者混合，移入1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，放置2 d，如液面降低，需再加水至刻度，搖勻，過濾即成。

葡萄糖標準溶液、次甲基藍指示劑、鹽酸、甲基紅指示劑、氫氧化鈉、甲醛、無CO2的水、氫氧化鈉標準滴定溶液、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞指示液：國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

DNP-9082型電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；HNY-2102C恒溫培養振蕩器：天津歐諾公司；RE52-99蒸餾裝置（直型冷凝回流管）：上海亞榮生化儀器廠；835型氨基酸自動分析儀：日立（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1霉菌的分離和純化

取1 g酒曲樣品，放入裝有99 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，振蕩20～30 min，即得稀釋度為10-2的稀釋液。用移液槍移取0.5 mL 10-2稀釋液到裝有4.5 mL無菌蒸餾水的小試管中，移液槍吹打，充分混勻，即制得稀釋度為10-3的稀釋液，采用同樣方法依次獲得稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液。分別將上述6個稀釋度的稀釋液，用移液槍移取0.1 mL到沙氏固體培養基上，用無菌涂布棒將其涂布均勻，分別做好標記。置于28℃恒溫倒置培養，3～4 d后觀察并記錄結果，每個稀釋度設置3個重復。

選取菌落生長密度合適的平板進行劃線分離，分別挑取菌落形態不同的孢子接種于空白的沙氏固體培養基上，劃線分離，直至長出狀態一致的菌落時為止。挑取適量孢子點種于新的平板上，待長出菌絲體后用無菌水沖洗孢子，制成10-1～10-6稀釋度的孢子懸液，分別取100 μL孢子稀釋液涂布于空白沙氏固體培養基上，平板上長出的單菌落即認為該菌的純培養。

1.3.2霉菌基因組脫氧核糖核酸的提取方法［18］

參考《基因工程實驗指導》關于真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取方法，提取霉菌菌株的基因組DNA。

1.3.3霉菌18S rDNA片段擴增

以真菌18S rDNA基因的通用引物作為序列擴增引物，以上述提取的DNA樣品為擴增模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaetion，PCR）擴增。通用引物序列、反應體系及PCR擴增條件如下所示：

18S1：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′18S2：5′-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3′

表1　18S rDNA基因的PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system of 18S rDNA gene

擴增條件：預變性94℃、5 min，變性94℃、1 min，退火56℃、2 min，延伸72℃、1 min，最后延伸72℃、10 min，30個循環，4℃保存。

1.3.4 PCR擴增產物的檢測及測序

取5 μL PCR擴增產物，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。瓊脂糖凝膠濃度：1%，電泳緩沖液：1×TAE，電泳條件：100 V、40 min。通過凝膠成像系統觀察電泳結果，選取條帶較亮的樣品送至上海生物工程公司進行測序。

1.3.5甜酒釀制備工藝流程

35℃保溫發酵，從發酵36 h開始，每隔12 h定時取樣，直到96 h，分別對米酒中的總糖、總酸、氨基酸態氮、酒精度、游離氨基酸等理化指標進行測定，研究其變化規律。

1.3.6測定方法

總糖、酒精度、總酸、氨基酸態氮含量測定方法：參考GB/T 13662—2008《黃酒國家標準》［19］。

游離氨基酸的測定：用氨基酸自動分析儀對樣品中的游離氨基酸種類和含量進行測定。

2　結果與分析

2.1霉菌的分離純化

從樣品中共分離得到5株不同菌落形態的霉菌，分別命名為FJ-M-1、FJ-M-2、FJ-M-3、FJ-M-4、FJ-M-5，提取這5株霉菌的DNA，以霉菌的18S1和18S2為上游和下游引物，PCR擴增霉菌的18S rDNA，如圖1所示。

圖1　菌株18S rDNA的PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 18S rDNA PCR amplification product of strain

擴增得到1 700 bp大小的片段，與已報道的18S rDNA擴增的片段大小相似。將PCR產物回收，送上海生工生物技術有限公司進行測序，將測序結果與NCBI數據庫中的已知序列進行BLAS比對分析，挑選與之相似度≥97%的菌株，利用MEGA 5.0構建系統進化樹結果見圖2。FJ-M-1和FJ-M-5與印度毛霉（Mucor indicus）JN974020相似度達到98%，FJ-M-2與單卷毛霉（Circinella simplex）KF805740相似度達到99%，FJ-M-3與單卷毛霉KF805739相似度達到99%，菌株FJ-M-4與Pilaira anomala菌株相似度為99%。將獲得的序列提交至NCBI的GeneBank數據庫，獲得登錄號為FJ-M-1（KM527227）、FJ-M-2（KM527228）、FJ-M-3（KM527229）、FJ-M-4（KM527230）、FJ-M-5（KM527231）。

圖2　5株霉菌的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of five moulds

2.2甜酒釀總糖、總酸、氨基酸態氮、酒精度的測定結果

取分別發酵36 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h的米酒，對其總糖、總酸、氨基酸態氮、酒精度等理化指標進行測定，測得結果見圖3。

圖3　甜酒釀中總糖（A）、總酸（B）、氨基酸態氮（C）、酒精度（D）的變化Fig.3 Changes of total sugar（A），total acid（B），amino acid nitrogen（C）and alcohol content（D）inJiuqu

由圖3A可知，總糖含量先升高、后降低，最后趨于穩定；主要是由于發酵初期霉菌的糖化作用使總糖含量升高，發酵后期酒釀中的酵母菌利用糖產酒精和其他有機酸等使總糖含量降低；在發酵60 h時達到最高值，為246 g/L。這說明甜酒曲中霉菌的糖化能力較好。

由圖3B可知，隨著發酵時間的延長，總酸含量呈逐漸升高的趨勢，發酵84 h時達到最高值為7.6 g/L，之后含量稍微降低，出現這種現象的原因可能與其中的酵母有關，由于酵母在發酵過程中先產酸，后產醇。

由圖3C可知，氨基酸態氮的含量先升高，然后趨于穩定：甜酒釀本身的氨基酸態氮的含量就偏低，在84 h時甜酒釀中氨基酸態氮達到最高，為0.3 g/L。

由圖3D可知，隨著發酵時間的延長，酒精度逐漸增加，48 h后趨于穩定，酒精度達到8.0%vol；這主要與酒曲中酵母菌的無氧發酵以及霉菌的糖化作用有關，不同微生物種類決定了甜酒釀酒精度的高低。

2.3游離氨基酸成分分析

本實驗分別選取發酵36 h、60 h、72 h和96 h的米酒作為研究對象，以此來研究氨基酸的變化。結果見表2。

表2　不同發酵時間甜酒釀中氨基酸含量Table 2 Contents of amino acid with different fermentation time mg/100 mL

由表2可知，20種氨基酸中，除谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn），其余18種氨基酸均存在于甜酒釀中，武漢民間酒釀中含有構成蛋白質的18種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸含量較高。氨基酸的總體趨勢是在發酵72 h時，氨基酸含量達到最高，之后的發酵中有所降低，這也充分說明，在民間米酒的發酵過程中48～72 h為最佳。

3　結論

從武漢民間酒曲中分離得到的5株霉菌中FJ-M-1、 FJ-M-2、FJ-M-3與FJ-M-5為毛霉，FJ-M-4為Pilaira anomala。對發酵產物甜酒釀營養成分分析得到，總糖含量可達到246 g/L，總酸含量達到7.6 g/L，氨基酸態氮的含量最高為0.3 g/L，酒精度能夠達到8.0%vol。武漢民間甜酒釀中含有構成蛋白質的18種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸含量較高。

［1］QUE F，MAO L C，ZHU C G，et al.Antioxidant properties of Chinese yellow wine，its concentrate and volatiles［J］.LWT-Food Sci Technol，2006，39（2）：111-117.

［2］SEO D H，JUNG J H，KIM H Y，et al.Identification of lactic acid bacteria involved in traditional Korean rice wine fermentation［J］.Food Sci Biotech，2007，16（6）：994-998.

［3］SUJAYA IN，ANTARA NS，SONE T，et al.Identification and characterization of yeasts in brem，a traditional Balinese rice wine［J］.World J Microb Biotech，2004，20（2）：143-150.

［4］蘭景軒.醪糟的保健食療［J］.家庭醫學，2005，20（1）：49.

［5］潘玲玲，王媚，羅明有，等.濃香型白酒黃水、窖泥中微生物總DNA提取方法比較［J］.中國釀造，2016，35（4）：42-46.

［6］胡懷玲.小曲的特點以及其中主要微生物間的關系［J］.釀酒，2008，35（5）：52-53.

［7］LV X C，HUANG Z Q，ZHANG W，et al.Identification and characterization of filamentous fungi isolated from fermentation starters for Hong Quglutinousricewinebrewing［J］.J DNA Gen Appl Microbiol，2012，58（1）：33-42

［8］KIM H R，KIM J H，BAI D H，et al.Identification and characterization of useful fungi with α-amylase activity from the Korean traditional Nuruk［J］.Mycobiology，2011，39（4）：278-282

［9］王和才，李金生，錢菊根.中國釀酒小曲生產現狀的調查與分析［J］.中國釀造，2011，30（5）：13-15.

［10］于博，董開發，張鳳英.廣東肇縣傳統酒曲優勢霉菌的分離及鑒定［J］.中國食品學報，2007（1）：95-98.

［11］周光來，田國政.酒曲根霉的純化篩選初報［J］.湖北民族學院學報：自然科學版，2000，18（4）：19-20.

［12］喻風香，陳煦，林親錄，等.酒曲根霉的分離純化及淀粉酶活力測定［J］.釀酒，2006，33（3）：39-41.

［13］姚淑敏，閆華文，陳璐.不同甜酒曲中可培養真菌的多樣性分析［J］.中國釀造，2015，34（12）：48-54.

［14］DUNG N T P，ROMBOUTS F M，NOUT M J R.Functionality of select-ed strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters［J］.Food Microbiol，2006，23：331-340.

［15］YANG S，LEE J，KWAK J，et al.Fungi associated with the traditional starter cultures used for rice wine in Korea［J］.J Kor Soc Appl Biol Chem，2011，54（6）：933-943.

［16］楊勇，陳衛平，馬蕤，等.甜酒釀營養成分分析與評價［J］.中國釀造，2011，30（6）：182-184.

［17］田亞紅，王巍杰，賈長虹，等.甜酒釀發酵工藝及過程中成分變化規律的研究［J］.食品科技，2008（6）：37-39.

［18］朱旭芬.基因工程實驗指導［M］.北京：高等教育出版社，2006：71-78.

［19］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 13662—2008黃酒［S］.北京：中國標準出版社，2008.

Isolation and identification of cultivable moulds in WuhanJiuquand analysis of nutritional components in fermented glutinous rice

CHEN Lu，YAO Shumin*，YAN Huawen
（Colloge of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China）

Cultivable strains were isolated and purified fromJiuqu.18S rDNA identification was conducted and the total sugar，alcohol，total acid，and amino acid nitrogen content was determined.Results showed that five mould strains isolated fromJiuquwere FJ-M-1，FJ-M-2，FJ-M-3，FJ-M-4，FJ-M-5.After identification，FJ-M-1 and FJ-M-5 were similar with Mucor JN974020，and the similarity was 98%.FJ-M-2 was similar with Mucor KF805740，and the similarity was 99%.FJ-M-3 was similar with KF805739，and the similarity was 99%.FJ-M-4 was similar withPilaira anomala，and the similarity was 99%.For nutrient analysis of fermented products，the total sugar content increased to the maximum of 246 g/L at 60 h，and then decreased.The total acid content increased gradually，and reached maximum of 7.6 g/L at 84 h.Amino acid nitrogen content increased and then tend to stable，and it reached maximum of 0.3 g/L at 84 h.The alcohol content was stable after 48 h，and it reached maximum of 8.0%vol.

Jiuqu；fermented glutinous rice；18S rDNA；mould；nutritional components

Q939.9

0254-5071（2016）07-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.013

2016-02-29

山東省青年基金資助項目（ZR2013EEQ009）；曲阜師范大學實驗室開放基金項目（sk201407）

陳璐（1991-），女，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發與利用。

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向為微生物資源開發和利用。