HPLC法測(cè)定梔制人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷的含量

曲　琰，賈天柱（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)院，沈陽(yáng)　110167；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

HPLC法測(cè)定梔制人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷的含量

曲琰1＊，賈天柱2#（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)院，沈陽(yáng)110167；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的：建立測(cè)定梔制人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent TC18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫，人參皂苷Rg1、Re、Rb1）、乙腈-水（13∶87，V/V，梔子苷），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm（人參皂苷Rg1、Re、Rb1）、238 nm（梔子苷），柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.418～3.762 μg（r=0.999 8）、0.270～2.430 μg（r=0.999 8）、0.398～3.582 μg（r=0.999 7）、0.606～3.030 μg （r=0.999 7）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.86%～101.47%（RSD=1.29%）、96.21%～100.11%（RSD=1.42%）、96.24%～100.48%（RSD=1.57%）、97.76%～102.44%（RSD=1.71%），n均為6。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于梔制人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷含量的測(cè)定。

梔制人參；人參皂苷；梔子苷；含量；高效液相色譜法

人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey的干燥根和根莖。多于秋季采挖，洗凈經(jīng)曬干或烘干。栽培品種俗稱(chēng)園參；播種在深林野生狀態(tài)下自然生長(zhǎng)的品種稱(chēng)林下山參，習(xí)稱(chēng)籽海［1］。人參自古以來(lái)就被人們視為“中藥之王”而馳名中外。在我國(guó)，人參的藥用可追溯到2 000年以前，其栽培史距今也有1 600余年。在我國(guó)最早的藥物學(xué)專(zhuān)著《神農(nóng)本草經(jīng)》上已有人參的記載，將其列為上品，認(rèn)為人參味甘微寒，主補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開(kāi)心益智，久服可輕身延年。現(xiàn)代藥理學(xué)研究主要從抗疲勞這個(gè)角度來(lái)闡釋人參的作用［2］?？墒?，由于人參具有溫燥之性，服用不當(dāng)或過(guò)量會(huì)引起機(jī)體氣機(jī)失調(diào)，產(chǎn)生動(dòng)血之患，導(dǎo)致“人參濫用綜合征”，表現(xiàn)為興奮過(guò)度，口鼻干燥出血，伴隨著失眠、神經(jīng)衰弱等病態(tài)反應(yīng)，甚至出現(xiàn)食欲減退、性情抑郁、低血壓、清晨腹瀉等癥［3］。

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，9～11月份果實(shí)成熟呈紅色時(shí)采收，除去果梗和雜質(zhì)，蒸至上氣或置沸水中略燙后取出干燥即得成品。梔子味苦，性寒，歸心、肺、三焦經(jīng)［1］，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效?！端幮再x》云：“梔子涼心腎，鼻衄最佳。”《藥性論》稱(chēng)梔子能“治時(shí)疾，除熱及消渴、口干、目赤腫痛?！背Ｓ糜跍夭「邿?、血熱吐衄、濕熱黃疸、濕熱淋癥、瘡瘍腫毒等癥的治療；外治扭傷跌損等［4-5］。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中藥配伍應(yīng)用會(huì)對(duì)藥物的有效物質(zhì)含量及藥理作用產(chǎn)生影響［6-8］。因此，筆者根據(jù)“相反為制”“以寒制熱”的傳統(tǒng)中藥炮制理論，在眾多寒性藥材中篩選出梔子作為輔料，以藥汁炮制法對(duì)人參進(jìn)行炮制研究。結(jié)果表明，人參經(jīng)新工藝炮制后，溫燥之性有所緩和，各種“熱性”指標(biāo)均有所降低［9］。藥物的質(zhì)量控制是藥物上市后安全、有效的保障［10］，因此筆者利用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定人參皂苷和梔子苷含量，使梔制人參安全、有效、質(zhì)量可控，并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

1　材料

1.1儀器

1100型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；FA1204B型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-3000型超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；

1.2試劑

人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201529）、人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)：110754-201324）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201424）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201316）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材與飲片

梔子、人參藥材（產(chǎn)地：遼寧）經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)炮制教研室鑒定為真品；梔制人參飲片（批號(hào)：080301、080302、080303、080304、080305、080306、080307、080308、080309、080310）由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)炮制教研室提供。

2　方法與結(jié)果

2.1人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量測(cè)定［11-12］

2.1.1色譜條件色譜柱：Agilent TC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以人參皂苷Rb1、Re、Rg1峰計(jì)均不少于5 000，分離度＞1.5，各成分基線分離良好，詳見(jiàn)圖1。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.1.2混合對(duì)照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成人參皂苷Rg1、Re、Rb1質(zhì)量濃度分別為0.1、0.4、0.8 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備取樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1 g，精密稱(chēng)定，置于索氏體取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 ml錐形瓶中，加水飽和正丁醇50 ml，密塞，放置過(guò)夜，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz，下同）處理30 min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4陰性對(duì)照溶液的制備以甲醇為陰性對(duì)照。

2.1.5線性關(guān)系考察分別稱(chēng)取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，加甲醇制成人參皂苷Rg1、Re、Rb1質(zhì)量濃度分別為0.188 1、0.121 5、0.179 1 mg的單一對(duì)照品溶液，倍比稀釋?zhuān)瞥上盗袉我粚?duì)照品溶液。精密量取上述系列單一對(duì)照品溶液各20 μl，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以人參皂苷Rg1、Re、Rb1進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見(jiàn)表2。

2.1.6精密度試驗(yàn)取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1峰面積的RSD分別為1.72%、1.54%、1.87%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：080301）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1峰面積的RSD分別為1.18%、1.30%、1.05%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1　人參皂苷Rg1、Re、Rb1的高效液相色譜圖A.梔制人參供試品；B.人參供試品；C.對(duì)照品；D.陰性對(duì)照；1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1Fig 1　HPLC chromatograms of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1A.test sample of P.ginseng processed by G.jasminoides；B.test sample of P.ginseng；C.reference substance；D.negative control；1.ginsenoside Rg1；2.ginsenoside Re；3.ginsenoside Rb1

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：080301）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，人參皂苷Rg1、Re、Rb1峰面積的RSD分別為1.61%、1.72%、1.43%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9加樣回收率試驗(yàn)取已知含量樣品（批號(hào)：080301）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.10樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量測(cè)定取樣品各適量，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2梔子苷含量測(cè)定［13-14］

2.2.1色譜條件色譜柱：Agilent TC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（13∶87，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以梔子苷峰計(jì)不少于1 500，分離度＞1.5，各成分基線分離良好，詳見(jiàn)圖2。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成梔子苷質(zhì)量濃度為30 μg/ml的對(duì)照品溶液。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 3　Results of recovery test（n=6）

表4　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab 4　Results of contents determination of samples（n=3）

2.2.3供試品溶液的制備取樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 ml，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 ml，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對(duì)照溶液的制備以甲醇為陰性對(duì)照。

2.2.5線性關(guān)系考察取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成梔子苷質(zhì)量濃度為0.151 5 mg/ml的對(duì)照品溶液，倍比稀釋?zhuān)瞥上盗袑?duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以梔子苷進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見(jiàn)表2。

2.2.6精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD=1.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖2　梔子苷的高效液相色譜圖A.梔制人參供試品；B.梔子供試品；C.對(duì)照品；D.陰性對(duì)照；1.梔子苷Fig 2　HPLC chromatograms of geniposideA.test sample of P.ginseng processed by G.jasminoides；B.test sample of G.jasminoides；C.reference substance；D.negative control；1.geniposide

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：080301）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD=1.58%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品（批號(hào)：080301）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD= 1.74%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn)取已知含量樣品（批號(hào)：080301）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的梔子苷對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.10樣品中梔子苷含量測(cè)定取樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3　討論

隨著人民生活水平的逐漸提高，越來(lái)越多的滋補(bǔ)保健品走進(jìn)了大家的日常生活，醫(yī)療模式也由單純的疾病治療轉(zhuǎn)向治療與預(yù)防保健相結(jié)合。目前，我國(guó)健康理念和消費(fèi)存在著巨大的落差，這也預(yù)示著我國(guó)保健品產(chǎn)業(yè)的無(wú)限前景。現(xiàn)今市場(chǎng)上出現(xiàn)了保齡參、活性參、人參口嚼片等多種人參制品，在不同程度上方便了人們服用，但在眾多新興的人參制品中，均沒(méi)有解決其藥性問(wèn)題，且不同的炮制加工方法會(huì)對(duì)人參及其飲片的質(zhì)量造成差異［15］。因此，尋找出一種新的炮制方法，既保留傳統(tǒng)人參的功效，又能降低人參的溫燥之性，更好地發(fā)揮其抗疲勞、抗衰老、益智等保健作用，成為亟待解決的課題。筆者由10批測(cè)定數(shù)據(jù)暫定梔人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷含量均應(yīng)不少于0.2%。綜上，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于梔制人參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和梔子苷含量的測(cè)定。

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（編輯：張靜）

Contents Determination of Ginsenoside Rg1，Re，Rb1and Geniposide in Panax ginseng Processed by Gardenia jasminoides by HPLC

QU Yan1，JIA Tianzhu2（1.College of Xinglin，Liaoning University of TCM，Shenyang 110167，China；2.College of Pharmacy，Liaoning University of TCM，Liaoning Dalian 116600，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1and geniposide in Panax ginseng processed by Gardenia jasminoides.METHODS：HPLC was performed on the column of Agilent TC18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid，（gradient elution，ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1）and acetonitrile-water（13∶87，V/V，geniposide）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 203 nm for ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1and 238 nm for geniposide，column temperature was 40℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 0.418-3.762 μg for ginsenoside Rg1（r=0.999 8），0.270-2.430 μg for Re（r=0.999 8），0.398-3.582 μg for ginsenoside Rb1（r=0.999 7）and 0.606-3.030 μg for geniposide（r=0.999 7）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were less than 2.0%；recoveries were 97.86%-101.47%（RSD=1.29%，n=6），96.21%-100.11%（RSD= 1.42%，n=6），96.24%-100.48%（RSD=1.57%，n=6）and 97.76%-102.44%（RSD=1.71%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the contents determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1and geniposide in P.ginseng processed by Gardenia jasminoides.

Panax ginseng processed by Gardenia jasminoides；Ginsenoside；Geniposide；Content；HPLC

R927文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3449-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.43

＊講師，碩士。研究方向：中藥炮制。E-mail：quyan821107@126/com

教授，碩士。研究方向：中藥炮制。E-mail：jiatzh@ 126.com

2016-03-22

2016-05-22）